Alcheimera slimībai (AD) trūkst proteīnu biomarķieru, kas atspoguļo tās daudzveidīgo patofizioloģiju, kavējot diagnozes un ārstēšanas progresu. Šeit mēs izmantojam visaptverošu proteomiku, lai identificētu cerebrospinālā šķidruma (CSF) biomarķierus, kas pārstāv plašu AD patofizioloģijas klāstu. Multipleksā masas spektrometrija identificēja attiecīgi aptuveni 3500 un aptuveni 12 000 proteīnu AD CSF un smadzenēs. Smadzeņu proteomas tīkla analīze atrisināja 44 bioloģiskās daudzveidības moduļus, no kuriem 15 pārklājās ar cerebrospinālā šķidruma proteomu. CSF AD marķieri šajos pārklāšanās moduļos ir salocīti piecās olbaltumvielu grupās, kas pārstāv dažādus patofizioloģiskos procesus. AD smadzenēs samazinās sinapses un metabolīti, bet palielinās CSF, savukārt smadzenēs un CSF palielinās ar glialiem bagātā mielinizācija un imūnās grupas. Paneļa izmaiņu konsistence un slimības specifika tika apstiprināta vairāk nekā 500 papildu CSF paraugos. Šīs grupas arī identificēja bioloģiskās apakšgrupas asimptomātiskā AD gadījumā. Kopumā šie rezultāti ir daudzsološs solis ceļā uz tīmekļa biomarķieru rīkiem klīniskiem lietojumiem AD.
Alcheimera slimība (AD) ir visizplatītākais neirodeģeneratīvās demences cēlonis visā pasaulē, un tai raksturīgs plašs bioloģisko sistēmu disfunkciju klāsts, tostarp sinaptiskā transmisija, glia mediētā imunitāte un mitohondriju metabolisms (1–3). Tomēr tā izveidotie proteīnu biomarķieri joprojām koncentrējas uz amiloīda un tau proteīna noteikšanu, un tāpēc tie nevar atspoguļot šo daudzveidīgo patofizioloģiju. Šie “galveno” proteīna biomarķieri, kurus visdrošāk mēra cerebrospinālajā šķidrumā (CSF), ietver (i) amiloīda beta peptīdu 1-42 (Aβ1-42), kas atspoguļo kortikālo amiloido plāksnīšu veidošanos; (ii) kopējais tau, aksona deģenerācijas pazīme; (iii) fosfo-tau (p-tau), patoloģiskās tau hiperfosforilācijas pārstāvis (4-7). Lai gan šie cerebrospinālā šķidruma biomarķieri ir ievērojami atvieglojuši mūsu “iezīmēto” AD proteīnu slimību noteikšanu (4–7), tie veido tikai nelielu daļu no sarežģītās slimības bioloģijas.
AD biomarķieru patofizioloģiskās daudzveidības trūkums ir radījis daudzas problēmas, tostarp (i) nespēju identificēt un kvantitatīvi noteikt AD pacientu bioloģisko neviendabīgumu, (ii) nepietiekamu slimības smaguma un progresēšanas mērījumu, īpaši preklīniskajā stadijā, un ( iii) tādu terapeitisku zāļu izstrāde, kas nespēja pilnībā atrisināt visus neiroloģiskās pasliktināšanās aspektus. Mūsu paļaušanās uz ievērojamo patoloģiju, lai aprakstītu AD no saistītām slimībām, šīs problēmas tikai saasina. Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka lielākajai daļai vecāka gadagājuma cilvēku ar demenci ir vairāk nekā viena kognitīvā samazināšanās patoloģiska iezīme (8). Pat 90% vai vairāk indivīdu ar AD patoloģiju ir arī asinsvadu slimības, TDP-43 ieslēgumi vai citas deģeneratīvas slimības (9). Šīs lielās patoloģiskās pārklāšanās proporcijas ir izjaukušas mūsu pašreizējo demences diagnostikas sistēmu, un ir nepieciešama visaptverošāka slimības patofizioloģiskā definīcija.
Ņemot vērā steidzamo vajadzību pēc dažādiem AD biomarķieriem, lauks arvien vairāk izmanto “omikas” metodi, kuras pamatā ir vispārējā sistēma biomarķieru atklāšanai. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD alianse tika izveidota 2014. gadā, un tā ir programmas priekšgalā. Šo Nacionālo veselības institūtu, akadēmisko aprindu un nozares daudznozaru centienu mērķis ir izmantot uz sistēmām balstītas stratēģijas, lai labāk definētu AD patofizioloģiju un izstrādātu bioloģiskās daudzveidības diagnostikas analīzes un ārstēšanas stratēģijas (10). Šī projekta ietvaros tīkla proteomika ir kļuvusi par daudzsološu līdzekli uz sistēmu balstītu biomarķieru attīstībai AD. Šī objektīva, uz datiem balstītā pieeja sakārto sarežģītas proteomikas datu kopas grupās vai "moduļos" no kopīgi izteiktiem proteīniem, kas ir saistīti ar konkrētiem šūnu tipiem, organellām un bioloģiskajām funkcijām (11-13). Ir veikti gandrīz 12 informācijas bagāti tīkla proteomikas pētījumi par AD smadzenēm (13-23). Kopumā šīs analīzes liecina, ka AD smadzeņu tīkla proteoms uztur ļoti konservētu modulāru organizāciju neatkarīgās grupās un vairākos kortikālajos reģionos. Turklāt daži no šiem moduļiem parāda reproducējamas izmaiņas ar AD saistītā pārpilnībā datu kopās, atspoguļojot vairāku slimību patofizioloģiju. Kopumā šie atklājumi parāda daudzsološu enkura punktu smadzeņu tīkla proteomas kā uz sistēmu balstīta biomarķiera atklāšanai AD.
Lai pārveidotu AD smadzeņu tīkla proteomu par klīniski noderīgiem uz sistēmu balstītiem biomarķieriem, mēs apvienojām no smadzenēm iegūto tīklu ar AD CSF proteomisko analīzi. Šī integrētā pieeja ļāva identificēt piecus daudzsološus CSF biomarķieru komplektus, kas ir saistīti ar plašu smadzeņu patofizioloģiju, tostarp sinapsēm, asinsvadiem, mielinizāciju, iekaisumu un vielmaiņas ceļu disfunkciju. Mēs veiksmīgi apstiprinājām šos biomarķieru paneļus, izmantojot vairākas replikācijas analīzes, tostarp vairāk nekā 500 CSF paraugus no dažādām neirodeģeneratīvām slimībām. Šīs validācijas analīzes ietver grupu mērķu pārbaudi CSF pacientiem ar asimptomātisku AD (AsymAD) vai pierādījumu uzrādīšanu par anormālu amiloīda uzkrāšanos normālā kognitīvā vidē. Šīs analīzes izceļ ievērojamo bioloģisko neviendabīgumu AsymAD populācijā un identificē paneļu marķierus, kas var apakštipizēt indivīdus slimības agrīnākajās stadijās. Kopumā šie rezultāti ir galvenais solis olbaltumvielu biomarķieru rīku izstrādē, kuru pamatā ir vairākas sistēmas, kas var veiksmīgi atrisināt daudzas klīniskās problēmas, ar kurām saskaras AD.
Šī pētījuma galvenais mērķis ir identificēt jaunus cerebrospinālā šķidruma biomarķierus, kas atspoguļo dažādas smadzeņu patofizioloģijas, kas izraisa AD. Attēlā S1 ir izklāstīta mūsu pētījuma metodoloģija, kas ietver (i) visaptverošu analīzi, kuras pamatā ir sākotnējie AD CSF un tīkla smadzeņu proteoma atklājumi, lai identificētu vairākus ar smadzenēm saistītus CSF slimību biomarķierus, un (ii) turpmāka replikācija Šie biomarķieri atrodas vairākos neatkarīgos cerebrospinālos orgānos. šķidruma kohortas. Uz atklājumiem orientētais pētījums sākās ar CSF diferenciālās ekspresijas analīzi 20 kognitīvi normāliem indivīdiem un 20 AD pacientiem Emory Goizueta Alcheimera slimības pētniecības centrā (ADRC). AD diagnoze tiek definēta kā nozīmīgs kognitīvs traucējums zema Aβ1-42 un paaugstināta kopējā tau un p-tau līmeņa klātbūtnē cerebrospinālajā šķidrumā [Mean Monreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (S1A tabula). Kontrolei (vidējais MoCA, 26,7 ± 2,2) bija normāls CSF biomarķieru līmenis.
Cilvēka CSF raksturo dinamisks proteīnu pārpilnības diapazons, kurā albumīns un citi ārkārtīgi bagātīgi proteīni var novērst interesējošo proteīnu noteikšanu (24). Lai palielinātu olbaltumvielu atklāšanas dziļumu, pirms masas spektrometrijas (MS) analīzes no katra CSF parauga noņēmām pirmos 14 ļoti bagātīgos proteīnus (24). Kopumā MS identificēja 39 805 peptīdus, kas tika kartēti uz 3691 proteomu 40 paraugos. Olbaltumvielu kvantitatīvo noteikšanu veic ar vairāku tandēma masas tagu (TMT) marķēšanu (18, 25). Lai atrisinātu trūkstošos datus, mēs iekļāvām tikai tos proteīnus, kas tika kvantificēti vismaz 50% paraugu turpmākajā analīzē, tādējādi beidzot kvantitatīvi nosakot 2875 proteomas. Tā kā kopējā olbaltumvielu daudzuma līmeņos ir būtiska atšķirība, kontroles paraugs statistiski tika uzskatīts par izņēmumu (13) un netika iekļauts turpmākajā analīzē. Atlikušo 39 paraugu pārpilnības vērtības tika koriģētas atbilstoši vecumam, dzimumam un partijas kovariācijai (13-15, 17, 18, 20, 26).
Izmantojot statistisko t-testa analīzi, lai novērtētu diferenciālo ekspresiju regresijas datu kopā, šī analīze identificēja proteīnus, kuru pārpilnības līmenis bija būtiski mainījies (P <0,05) starp kontroles un AD gadījumiem (S2A tabula). Kā parādīts 1A attēlā, kopumā 225 proteīnu daudzums AD tika ievērojami samazināts, un 303 proteīnu pārpilnība tika ievērojami palielināta. Šie atšķirīgi ekspresētie proteīni ietver vairākus iepriekš identificētus cerebrospinālā šķidruma AD marķierus, piemēram, ar mikrotubuliem saistīto tau proteīnu (MAPT; P = 3,52 × 10–8), neirofilamentu (NEFL; P = 6,56 × 10–3), ar augšanu saistīto proteīnu 43. (GAP43; P = 1,46 × 10-5), taukskābes saistošais proteīns 3 (FABP3; P = 2,00 × 10-5), hitināze 3 līdzīgs 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), nervu granuls (NRGN; P = 3,43 × 10-4) un VGF nervu augšanas faktors (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Tomēr mēs identificējām arī citus ļoti svarīgus mērķus, piemēram, IKP disociācijas inhibitoru 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) un ar SPARC saistīto modulāro kalcija saistīšanos 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). 225 ievērojami samazinātu proteīnu gēnu ontoloģijas (GO) analīze atklāja ciešu saikni ar ķermeņa šķidruma procesiem, piemēram, steroīdu metabolismu, asins koagulāciju un hormonu aktivitāti (1.B attēls un S2B tabula). Turpretī ievērojami palielinātais 303 proteīns ir cieši saistīts ar šūnu struktūru un enerģijas metabolismu.
(A) Vulkāna diagramma parāda log2 reizes izmaiņas (x ass) attiecībā pret -log10 statistisko P vērtību (y ass), kas iegūta ar t-testu, ko izmanto, lai noteiktu diferenciālo izteiksmi starp kontroles (CT) un Visu proteīnu CSF proteomu AD gadījumi. Olbaltumvielas ar ievērojami samazinātu līmeni (P <0, 05) AD ir parādītas zilā krāsā, savukārt olbaltumvielas ar ievērojami paaugstinātu slimības līmeni ir parādītas sarkanā krāsā. Izvēlētais proteīns ir marķēts. (B) Galvenie GO termini, kas saistīti ar proteīnu, AD ir ievērojami samazināti (zilā krāsā) un palielināti (sarkanā krāsā). Parāda trīs GO terminus ar augstākajiem z rādītājiem bioloģisko procesu, molekulāro funkciju un šūnu komponentu jomā. (C) MS mērīja MAPT līmeni CSF paraugā (pa kreisi) un tā korelāciju ar parauga ELISA tau līmeni (pa labi). Tiek parādīts Pīrsona korelācijas koeficients ar attiecīgo P vērtību. Tā kā vienam AD gadījumam trūkst ELISA datu, šie skaitļi ietver vērtības 38 no 39 analizētajiem gadījumiem. (D) Uzraudzītā klasteru analīze (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) koriģēts P <0,01) kontroles un AD CSF atrada paraugus, izmantojot 65 visbūtiskāk mainītos proteīnus datu kopā. Standartizēt, normalizēt.
MAPT proteomiskais līmenis ir cieši saistīts ar neatkarīgi izmērīto ELISA tau līmeni (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; 1.C attēls), kas apstiprina mūsu MS mērījuma derīgumu. Pēc tripsīna sagremošanas amiloīda prekursoru proteīna (APP) līmenī izoformai specifiskos peptīdus, kas kartēti uz Aβ1-40 un Aβ1-42 C-galu, nevar efektīvi jonizēt (27, 28). Tāpēc mūsu identificētajiem APP peptīdiem nav nekā kopīga ar ELISA Aβ1-42 līmeni. Lai novērtētu katra gadījuma diferenciālo ekspresiju, mēs izmantojām atšķirīgi izteiktus proteīnus ar P <0,0001 [viltus atklāšanas ātrums (FDR) koriģēts P <0,01], lai veiktu uzraudzītu paraugu klasteru analīzi (S2A tabula). Kā parādīts 1D attēlā, šie 65 ļoti nozīmīgie proteīni var pareizi grupēt paraugus atbilstoši slimības stāvoklim, izņemot vienu AD gadījumu ar kontrolei līdzīgām īpašībām. No šiem 65 proteīniem 63 palielinājās AD, bet tikai divi (CD74 un ISLR) samazinājās. Kopumā šīs cerebrospinālā šķidruma analīzes ir identificējušas simtiem proteīnu AD, kas var kalpot kā slimības biomarķieri.
Pēc tam mēs veicām neatkarīgu AD smadzeņu proteomas tīkla analīzi. Šī atklājuma smadzeņu grupā bija iekļauta dorsolaterālā prefrontālā garoza (DLPFC) no kontroles (n = 10), Parkinsona slimības (PD; n = 10), jaukta AD/PD (n = 10) un AD (n = 10) gadījumi. ) Paraugs. Emerija Goizueta ADRC. Šo 40 gadījumu demogrāfija ir aprakstīta iepriekš (25), un tā ir apkopota S1B tabulā. Mēs izmantojām TMT-MS, lai analizētu šos 40 smadzeņu audus un 27 gadījumu replikācijas kohortu. Kopumā šīs divas smadzeņu datu kopas radīja 227 121 unikālu peptīdu, kas tika kartēti uz 12 943 proteomiem (25). Turpmākajās izmeklēšanās tika iekļautas tikai tās olbaltumvielas, kas tika kvantitatīvi noteiktas vismaz 50% gadījumu. Galīgajā atklājumu datu kopā ir 8817 kvantitatīvi noteikti proteīni. Pielāgojiet olbaltumvielu pārpilnības līmeni, pamatojoties uz vecumu, dzimumu un pēcnāves intervālu (PMI). Datu kopas diferenciālās ekspresijas analīze pēc regresijas parādīja, ka vairāk nekā 2000 olbaltumvielu līmeņi ir būtiski mainījušies [P <0,05, dispersijas analīze (ANOVA)] divās vai vairākās slimību grupās. Pēc tam mēs veicām uzraudzītu klasteru analīzi, pamatojoties uz diferencēti izteiktiem proteīniem un P <0, 0001 AD / kontroles un / vai AD / PD salīdzinājumos (S2, A un B attēls, S2C tabula). Šie 165 ļoti izmainītie proteīni skaidri attēlo gadījumus ar AD patoloģiju no kontroles un PD paraugiem, apstiprinot spēcīgās AD specifiskās izmaiņas visā proteomā.
Pēc tam mēs izmantojām algoritmu, ko sauc par svērto gēnu koekspresijas tīkla analīzi (WGCNA), lai veiktu tīkla analīzi atklātajā smadzeņu proteomā, kas sakārto datu kopu proteīnu moduļos ar līdzīgiem ekspresijas modeļiem (11-13). Analīze identificēja 44 moduļus (M) līdzekspresētus proteīnus, kas sakārtoti un numurēti no lielākajiem (M1, n = 1821 proteīns) līdz mazākajam (M44, n = 34 proteīni) (2.A attēls un S2D tabula)). Kā minēts iepriekš (13) Aprēķiniet katra moduļa reprezentatīvo ekspresijas profilu vai raksturīgo proteīnu un korelējiet to ar slimības stāvokli un AD patoloģiju, tas ir, izveidojiet Alcheimera slimības reģistra (CERAD) un Braak Score aliansi (2.B attēls). Kopumā 17 moduļi bija nozīmīgi saistīti ar AD neiropatoloģiju (P <0, 05). Daudzi no šiem ar slimību saistītajiem moduļiem ir arī bagāti ar šūnu tipam raksturīgiem marķieriem (2.B attēls). Kā minēts iepriekš (13), šūnu tipa bagātināšanu nosaka, analizējot moduļa pārklāšanos un šūnu tipam raksturīgo gēnu atsauces sarakstu. Šie gēni ir iegūti no publicētiem datiem izolētos peles neironos, endotēlija un glia šūnās. RNS sekvencēšanas (RNA-seq) eksperiments (29).
(A) Atklājiet smadzeņu proteomas WGCNA. (B) Modulārā paraksta proteīna (pirmā galvenā moduļu proteīna ekspresijas sastāvdaļa) divsvara vidējās korelācijas (BiCor) analīze ar AD neiropatoloģiskajām īpašībām (augšpusē), ieskaitot CERAD (Aβ plāksne) un Braak (tau tangles) rādītājus. Pozitīvo (sarkano) un negatīvo (zilo) korelāciju intensitāte ir parādīta ar divu krāsu siltuma karti, un zvaigznītes norāda statistisko nozīmīgumu (P <0,05). Izmantojiet hiperģeometrisko Fišera eksakto testu (FET) (apakšā), lai novērtētu katra proteīna moduļa šūnu tipa saistību. Sarkanā ēnojuma intensitāte norāda šūnu tipa bagātināšanas pakāpi, un zvaigznīte norāda statistisko nozīmīgumu (P <0,05). Izmantojiet BH metodi, lai labotu no FET iegūto P vērtību. (C) modulāro proteīnu GO analīze. Katram modulim vai saistīto moduļu grupai ir parādīti visciešāk saistītie bioloģiskie procesi. oligo, oligodendrocīts.
Piecu cieši saistītu astrocītu un mikrogliju moduļu komplekts (M30, M29, M18, M24 un M5) uzrādīja spēcīgu pozitīvu korelāciju ar AD neiropatoloģiju (2.B attēls). Ontoloģijas analīze saista šos glia moduļus ar šūnu augšanu, proliferāciju un imunitāti (2.C attēls un S2E tabula). Divi papildu glia moduļi, M8 un M22, arī ir stipri pārregulēti slimības gadījumā. M8 ir ļoti saistīts ar Toll līdzīgu receptoru ceļu, signalizācijas kaskādi, kam ir galvenā loma iedzimtajā imūnreakcijā (30). Tajā pašā laikā M22 ir cieši saistīts ar pēctranslācijas modifikāciju. M2, kas ir bagāts ar oligodendrocītiem, uzrāda spēcīgu pozitīvu korelāciju ar AD patoloģiju un ontoloģisko saikni ar nukleozīdu sintēzi un DNS replikāciju, kas norāda uz pastiprinātu šūnu proliferāciju slimībās. Kopumā šie atklājumi atbalsta glia moduļu paaugstināšanos, ko iepriekš esam novērojuši AD tīkla proteomā (13, 17). Pašlaik ir konstatēts, ka daudziem ar AD saistītiem glia moduļiem tīklā ir zemāki ekspresijas līmeņi kontroles un PD gadījumos, izceļot to slimības specifiku, kas ir paaugstināta AD (attēls S2C).
Tikai četri moduļi mūsu tīkla proteomā (M1, M3, M10 un M32) ir stipri negatīvi korelēti ar AD patoloģiju (P <0,05) (2. attēls, B un C). Gan M1, gan M3 ir bagāti ar neironu marķieriem. M1 ir ļoti saistīts ar sinaptiskajiem signāliem, savukārt M3 ir cieši saistīts ar mitohondriju funkciju. Nav pierādījumu par M10 un M32 šūnu tipa bagātināšanu. M32 atspoguļo saikni starp M3 un šūnu metabolismu, savukārt M10 ir ļoti saistīts ar šūnu augšanu un mikrotubulu funkciju. Salīdzinot ar AD, visi četri moduļi ir palielināti kontrolē un PD, dodot tiem slimībai specifiskas AD izmaiņas (S2C attēls). Kopumā šie rezultāti atbalsta neironiem bagāto moduļu skaita samazināšanos, ko esam iepriekš novērojuši AD (13, 17). Rezumējot, mūsu atklātā smadzeņu proteoma tīkla analīze radīja AD specifiski mainītus moduļus, kas atbilst mūsu iepriekšējiem atklājumiem.
AD raksturo agrīna asimptomātiska stadija (AsymAD), kurā indivīdiem ir amiloīda uzkrāšanās bez klīniskas kognitīvās pasliktināšanās (5, 31). Šis asimptomātiskais posms ir kritisks logs agrīnai atklāšanai un iejaukšanās. Mēs jau iepriekš esam pierādījuši spēcīgu AsymAD un AD smadzeņu tīkla proteomu modulāru saglabāšanu neatkarīgās datu kopās (13, 17). Lai nodrošinātu, ka pašlaik atklātais smadzeņu tīkls atbilst šiem iepriekšējiem atklājumiem, mēs analizējām 44 moduļu saglabāšanu replicētajā datu kopā no 27 DLPFC organizācijām. Šīs organizācijas ietver kontroles (n = 10), AsymAD (n = 8) un AD (n = 9) gadījumus. Kontroles un AD paraugi tika iekļauti mūsu atklājumu smadzeņu kohortas analīzē (S1B tabula), savukārt AsymAD gadījumi bija unikāli tikai replikācijas grupā. Šie AsymAD gadījumi arī tika iegūti no Emory Goizueta ADRC smadzeņu bankas. Lai gan nāves brīdī izziņa bija normāla, amiloīda līmenis bija neparasti augsts (vidējais CERAD, 2,8 ± 0,5) (S1B tabula).
Šo 27 smadzeņu audu TMT-MS analīzes rezultātā tika kvantitatīvi noteikti 11 244 proteomi. Šis galīgais skaits ietver tikai tās olbaltumvielas, kas kvantitatīvi noteiktas vismaz 50% paraugu. Šajā replicētajā datu kopā ir 8638 (98,0%) no 8817 proteīniem, kas tika atklāti mūsu atklājuma smadzeņu analīzē, un tajā ir gandrīz 3000 būtiski mainījušies proteīni starp kontroles un AD kohortu (P <0,05, pēc Tūkija pāra t testa dispersijas analīzei) ( Tabula S2F). Starp šiem atšķirīgi ekspresētajiem proteīniem 910 arī uzrādīja būtiskas līmeņa izmaiņas starp AD un smadzeņu proteomu kontroles gadījumiem (P <0, 05, pēc ANOVA Tukey pāra t-testa). Ir vērts atzīmēt, ka šie 910 marķieri ir ļoti konsekventi izmaiņu virzienā starp proteomiem (r = 0, 94, P <1, 0 × 10-200) (S3A attēls). Starp palielinātajiem proteīniem olbaltumvielas ar konsekventākajām izmaiņām starp datu kopām galvenokārt ir glialiem bagāto M5 un M18 moduļu (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 un GFAP) dalībnieki. Starp samazinātajiem proteīniem tie, kuriem bija viskonsekventākās izmaiņas, bija gandrīz tikai M1 moduļa locekļi (NPTX2, VGF un RPH3A), kas saistīti ar sinapsēm. Mēs tālāk pārbaudījām ar AD saistītās midkine (MDK), CD44, izdalītā ar frizzled saistītā proteīna 1 (SFRP1) un VGF izmaiņas ar Western blotēšanu (S3B attēls). Moduļu saglabāšanas analīze parādīja, ka aptuveni 80% proteīna moduļu (34/44) smadzeņu proteomā replikācijas datu kopā bija ievērojami konservēti (z-score> 1,96, FDR koriģēts P <0,05) (S3C attēls). Četrpadsmit no šiem moduļiem tika īpaši rezervēti starp diviem proteomiem (z-score> 10, FDR koriģēts P <1,0 × 10-23). Kopumā smadzeņu proteomu diferenciālās ekspresijas un modulārā sastāva augstās konsekvences atklāšana un replikācija izceļ AD frontālās garozas proteīnu izmaiņu reproducējamību. Turklāt tas arī apstiprināja, ka AsymAD un progresīvākām slimībām ir ļoti līdzīga smadzeņu tīkla struktūra.
Detalizētāka diferenciālās ekspresijas analīze smadzeņu replikācijas datu kopā izceļ ievērojamo AsymAD proteīna izmaiņu pakāpi, tostarp kopumā 151 būtiski mainītu proteīnu starp AsymAD un kontroli (P <0, 05) (S3D attēls). Atbilstoši amiloīda slodzei APP AsymAD un AD smadzenēs ievērojami palielinājās. MAPT tikai būtiski mainās AD, kas atbilst paaugstinātam samezglojuma līmenim un tā zināmajai korelācijai ar kognitīvo samazināšanos (5, 7). Ar glialiem bagātie moduļi (M5 un M18) ir ļoti atspoguļoti palielinātajos proteīnos AsymAD, savukārt ar neironiem saistītais M1 modulis ir visizteiktākais no AsymAD samazinātajiem proteīniem. Daudzi no šiem AsymAD marķieriem uzrāda lielākas izmaiņas simptomātiskajās slimībās. Starp šiem marķieriem ir SMOC1, glia proteīns, kas pieder M18, kas ir saistīts ar smadzeņu audzējiem un acu un ekstremitāšu attīstību (32). MDK ir heparīnu saistošs augšanas faktors, kas saistīts ar šūnu augšanu un angiogenēzi (33), vēl viens M18 loceklis. Salīdzinot ar kontroles grupu, AsymAD ievērojami palielinājās, kam sekoja lielāks AD pieaugums. Turpretī sinaptiskais proteīns neiropentraksīns 2 (NPTX2) tika ievērojami samazināts AsymAD smadzenēs. NPTX2 iepriekš bija saistīts ar neirodeģenerāciju, un tam ir atzīta loma ierosmes sinapses starpniecībā (34). Kopumā šie rezultāti atklāj dažādas dažādas preklīniskas proteīna izmaiņas AD, kas, šķiet, progresē līdz ar slimības smagumu.
Ņemot vērā, ka smadzeņu proteoma atklāšanā esam sasnieguši ievērojamu proteīnu pārklājuma dziļumu, mēs cenšamies pilnīgāk izprast tā pārklāšanos ar tīkla līmeņa AD transkriptu. Tāpēc mēs salīdzinājām mūsu atklāto smadzeņu proteomu ar moduli, ko iepriekš izveidojām, veicot 18 204 gēnu mikromatricas mērījumus AD (n = 308) un kontroles (n = 157) DLPFC audos (13). pārklājas. Kopumā mēs identificējām 20 dažādus RNS moduļus, no kuriem daudzi demonstrēja specifisku šūnu tipu, tostarp neironu, oligodendrocītu, astrocītu un mikrogliju, bagātināšanu (3.A attēls). Šo moduļu daudzkārtējās izmaiņas AD ir parādītas 3.B attēlā. Saskaņā ar mūsu iepriekšējo proteīna-RNS pārklāšanās analīzi, izmantojot dziļāku nemarķēto MS proteomu (apmēram 3000 proteīnu) (13), lielākā daļa no mūsu atrastajiem 44 smadzeņu proteomu tīkla moduļiem atrodas transkripta tīklā. Nav būtiskas pārklāšanās. Atklājot un atkārtojot 34 proteīna moduļus, kas ir ļoti saglabāti smadzeņu proteomā, tikai 14 (~ 40%) izturēja Fišera precīzo testu (FET), izrādījās, ka tiem ir statistiski nozīmīga pārklāšanās ar transkriptu (3.A attēls). Savietojams ar DNS bojājumu labošanu (P-M25 un P-M19), proteīnu translāciju (P-M7 un P-M20), RNS saistīšanu/savienošanos (P-M16 un P-M21) un proteīnu mērķēšanu (P-M13 un P- M23) nepārklājas ar moduļiem transkriptā. Tāpēc, lai gan pašreizējā pārklāšanās analīzē tiek izmantota dziļāka proteomu datu kopa (13), lielākā daļa AD tīkla proteomu nav kartēta ar transkripta tīklu.
(A) Hiperģeometriskā FET parāda šūnu tipam raksturīgo marķieru bagātināšanu AD transkripta RNS modulī (augšpusē) un pārklāšanās pakāpi starp AD smadzeņu RNS (x ass) un proteīna (y ass) moduļiem. (apakšā) . Sarkanā ēnojuma intensitāte norāda šūnu tipu bagātināšanas pakāpi augšējā panelī un moduļu pārklāšanās intensitāti apakšējā panelī. Zvaigznītes norāda statistisko nozīmīgumu (P <0,05). (B) Korelācijas pakāpe starp katra transkripta moduļa raksturīgajiem gēniem un AD statusu. Kreisajā pusē esošie moduļi ir visnegatīvāk korelēti ar AD (zilā krāsā), un tie, kas atrodas labajā pusē, ir vispozitīvāk korelēti ar AD (sarkanā krāsā). Ar logaritmi pārveidotā BH koriģētā P vērtība norāda katras korelācijas statistiskā nozīmīguma pakāpi. (C) Būtiski pārklāšanās moduļi ar kopīgu šūnu tipa bagātināšanu. (D) Marķētā proteīna (x-ass) un RNS (y-ass) log2 reizes izmaiņu korelācijas analīze pārklāšanās modulī. Tiek parādīts Pīrsona korelācijas koeficients ar attiecīgo P vērtību. Mikro, mikroglia; debess ķermeņi, astrocīti. CT, kontrole.
Lielākajai daļai proteīnu un RNS moduļu, kas pārklājas, ir līdzīgi šūnu tipa bagātināšanas profili un konsekventi AD maiņas virzieni (3. attēls, B un C). Citiem vārdiem sakot, ar sinapsēm saistītais smadzeņu proteomas M1 modulis (PM1) ir kartēts ar trim neironiem bagātiem homologiem RNS moduļiem (R-M1, R-M9 un R-M16), kas atrodas AD. Abi parādīti. pazemināts līmenis. Līdzīgi ar glialiem bagātie M5 un M18 proteīnu moduļi pārklājas ar RNS moduļiem, kas bagāti ar astrocītiem un mikroglia marķieriem (R-M3, R-M7 un R-M10), un tie ir ļoti iesaistīti slimībās. Šīs kopīgās modulārās funkcijas starp abām datu kopām vēl vairāk atbalsta šūnu tipa bagātināšanu un ar slimībām saistītās izmaiņas, ko esam novērojuši smadzeņu proteomā. Tomēr mēs novērojām daudzas būtiskas atšķirības starp atsevišķu marķieru RNS un olbaltumvielu līmeni šajos kopīgajos moduļos. Molekulu proteomikas un transkriptomikas diferenciālās izteiksmes korelācijas analīze šajos pārklāšanās moduļos (3D attēls) izceļ šo neatbilstību. Piemēram, APP un vairāki citi glia moduļa proteīni (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 un SFRP1) uzrādīja ievērojamu AD proteomu pieaugumu, bet AD transkriptā gandrīz nebija nekādu izmaiņu. Šīs proteīnam specifiskās izmaiņas var būt cieši saistītas ar amiloīda plāksnēm (23, 35), izceļot proteomu kā patoloģisku izmaiņu avotu, un šīs izmaiņas var neatspoguļoties transkriptā.
Pēc mūsu atklāto smadzeņu un CSF proteomu neatkarīgas analīzes mēs veicām visaptverošu divu datu kopu analīzi, lai identificētu AD CSF biomarķierus, kas saistīti ar smadzeņu tīkla patofizioloģiju. Vispirms mums jādefinē divu proteomu pārklāšanās. Lai gan ir plaši atzīts, ka CSF atspoguļo neiroķīmiskās izmaiņas AD smadzenēs (4), precīza AD smadzeņu un CSF proteomu pārklāšanās pakāpe nav skaidra. Salīdzinot mūsu abos proteomos konstatēto kopīgo gēnu produktu skaitu, mēs atklājām, ka gandrīz 70% (n = 1936) no cerebrospinālajā šķidrumā identificētajiem proteīniem tika kvantitatīvi noteikti arī smadzenēs (4.A attēls). Lielākā daļa no šiem pārklājošajiem proteīniem (n = 1721) ir kartēti vienā no 44 koekspresijas moduļiem no smadzeņu atklāšanas datu kopas (4.B attēls). Kā gaidīts, sešiem lielākajiem smadzeņu moduļiem (M1 līdz M6) bija vislielākā CSF pārklāšanās. Tomēr ir mazāki smadzeņu moduļi (piemēram, M15 un M29), kas sasniedz negaidīti augstu pārklāšanās pakāpi, kas ir lielāka nekā smadzeņu modulis, kas ir divreiz lielāks. Tas motivē mūs pieņemt detalizētāku, statistiski pamatotu metodi, lai aprēķinātu smadzeņu un cerebrospinālā šķidruma pārklāšanos.
(A un B) Atklāšanas smadzeņu un CSF datu kopās atklātie proteīni pārklājas. Lielākā daļa no šiem pārklājošajiem proteīniem ir saistīti ar vienu no 44 smadzeņu koekspresijas tīkla koekspresijas moduļiem. (C) Atklājiet pārklāšanos starp cerebrospinālā šķidruma proteomu un smadzeņu tīkla proteomu. Katra siltuma kartes rinda ir atsevišķa hiperģeometriskā FET pārklāšanās analīze. Augšējā rindā ir attēlota pārklāšanās (pelēks/melns ēnojums) starp smadzeņu moduli un visu CSF proteomu. Otrajā rindā ir attēlots, ka pārklāšanās starp smadzeņu moduļiem un CSF proteīnu (iekrāsota sarkanā krāsā) ir ievērojami paaugstināta AD gadījumā (P <0, 05). Trešā rinda parāda, ka pārklāšanās starp smadzeņu moduļiem un CSF proteīnu (zils ēnojums) ir ievērojami samazināts AD (P <0, 05). Izmantojiet BH metodi, lai labotu no FET iegūto P vērtību. (D) Saliekamā moduļa panelis, kura pamatā ir šūnu tipa asociācija un saistītie GO termini. Šajos paneļos kopumā ir 271 ar smadzenēm saistīts proteīns, kam ir nozīmīga atšķirīga ekspresija CSF proteomā.
Izmantojot vienvirziena FET, mēs novērtējām olbaltumvielu pārklāšanās nozīmi starp CSF proteomu un atsevišķiem smadzeņu moduļiem. Analīze atklāja, ka kopumā 14 smadzeņu moduļiem CSF datu kopā ir statistiski nozīmīgas pārklāšanās (FDR koriģēts P <0,05) un papildu modulim (M18), kura pārklāšanās ir tuvu nozīmīgumam (FDR koriģēts P = 0,06) (4C attēls). , augšējā rinda). Mūs interesē arī moduļi, kas stipri pārklājas ar atšķirīgi ekspresētiem CSF proteīniem. Tāpēc mēs izmantojām divas papildu FET analīzes, lai noteiktu, kurš no (i) CSF proteīns bija ievērojami palielināts AD gadījumā un (ii) CSF proteīns bija ievērojami samazināts AD (P <0,05, sapārots t tests AD/kontrole) smadzeņu moduļiem ar nozīmīgu pārklāšanos. starp tām. Kā parādīts 4C attēla vidējā un apakšējā rindā, šīs papildu analīzes parāda, ka 8 no 44 smadzeņu moduļiem ievērojami pārklājas ar proteīnu, kas pievienots AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 un M38). . ), savukārt tikai divi moduļi (M6 un M15) uzrādīja nozīmīgu pārklāšanos ar samazinātu proteīnu AD CSF. Kā gaidīts, visi 10 moduļi atrodas 15 moduļos ar vislielāko pārklāšanos ar CSF proteomu. Tāpēc mēs pieņemam, ka šie 15 moduļi ir augstas ražības avoti no AD smadzenēm iegūtiem CSF biomarķieriem.
Mēs salokām šos 15 pārklājošos moduļus piecos lielos proteīna paneļos, pamatojoties uz to tuvumu WGCNA koka diagrammā un to saistību ar šūnu tipiem un gēnu ontoloģiju (4D attēls). Pirmajā panelī ir moduļi, kas bagāti ar neironu marķieriem un ar sinapsēm saistītiem proteīniem (M1 un M12). Sinaptiskais panelis satur pavisam 94 proteīnus, un CSF proteomas līmenis ir ievērojami mainījies, padarot to par lielāko ar smadzenēm saistīto CSF marķieru avotu starp pieciem paneļiem. Otrā grupa (M6 un M15) demonstrēja ciešu saikni ar endotēlija šūnu marķieriem un asinsvadu ķermeni, piemēram, “brūču dzīšanu” (M6) un “humorālās imūnās atbildes regulēšanu” (M15). M15 ir arī ļoti saistīts ar lipoproteīnu metabolismu, kas ir cieši saistīts ar endotēliju (36). Asinsvadu panelī ir 34 CSF marķieri, kas saistīti ar smadzenēm. Trešajā grupā ietilpst moduļi (M2 un M4), kas ir būtiski saistīti ar oligodendrocītu marķieriem un šūnu proliferāciju. Piemēram, M2 augstākā līmeņa ontoloģijas terminos ietilpst “pozitīvs DNS replikācijas regulējums” un “purīna biosintēzes process”. Tikmēr M4 tie ietver “glia šūnu diferenciāciju” un “hromosomu segregāciju”. Mielinizācijas panelī ir 49 CSF marķieri, kas saistīti ar smadzenēm.
Ceturtajā grupā ir visvairāk moduļu (M30, M29, M18, M24 un M5), un gandrīz visi moduļi ir ievērojami bagāti ar mikrogliju un astrocītu marķieriem. Līdzīgi kā mielinizācijas panelī, ceturtajā panelī ir arī moduļi (M30, M29 un M18), kas ir cieši saistīti ar šūnu proliferāciju. Pārējie šīs grupas moduļi ir ļoti saistīti ar imunoloģiskiem terminiem, piemēram, “imūnās iedarbības process” (M5) un “imūnās atbildes regulēšana” (M24). Gliāla imūngrupa satur 42 CSF marķierus, kas saistīti ar smadzenēm. Visbeidzot, pēdējā panelī ir iekļauti 52 ar smadzenēm saistīti marķieri četros moduļos (M44, M3, M33 un M38), kas visi ir uz ķermeņa, kas saistīti ar enerģijas uzglabāšanu un vielmaiņu. Lielākais no šiem moduļiem (M3) ir cieši saistīts ar mitohondrijiem un ir bagāts ar neironiem specifiskiem marķieriem. M38 ir viens no mazākajiem moduļa dalībniekiem šajā metabolomā, un tam ir arī mērena neironu specifika.
Kopumā šie pieci paneļi atspoguļo plašu šūnu tipu un funkciju klāstu AD garozā, un tie kopā satur 271 ar smadzenēm saistītu CSF marķieri (S2G tabula). Lai novērtētu šo MS rezultātu derīgumu, mēs izmantojām tuvuma pagarinājuma testu (PEA), ortogonālu antivielu balstītu tehnoloģiju ar multipleksēšanas iespējām, augstu jutību un specifiskumu, un atkārtoti analizējām cerebrospinālā šķidruma paraugus, ko atradām šo 271 biomarķiera apakškopu. (n = 36). Šie 36 mērķi parāda izmaiņas PEA AD daudzkārtnē, kas ir cieši saistīta ar mūsu MS konstatējumiem (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), kas stingri apstiprināja mūsu visaptverošās MS analīzes rezultātus (S4 attēls). ).
Mūsu piecu grupu uzsvērtās bioloģiskās tēmas, sākot no sinaptiskās signalizācijas līdz enerģijas metabolismam, ir saistītas ar AD patoģenēzi (1-3). Tāpēc visi 15 moduļi, kas satur šos paneļus, ir saistīti ar mūsu atklāto AD patoloģiju smadzeņu proteomā (2.B attēls). Visievērojamākā ir augstā pozitīvā patoloģiskā korelācija starp mūsu glia moduļiem un spēcīgā negatīvā patoloģiskā korelācija starp mūsu lielākajiem neironu moduļiem (M1 un M3). Mūsu replicētā smadzeņu proteoma diferenciālās ekspresijas analīze (attēls S3D) izceļ arī no M5 un M18 iegūtos glia proteīnus. AsymAD un simptomātiskā AD gadījumā visvairāk palielināts glia proteīnu daudzums un ar M1 saistītās sinapses. Proteīns tiek samazināts visvairāk. Šie novērojumi liecina, ka 271 cerebrospinālā šķidruma marķieris, ko identificējām piecās grupās, ir saistīti ar slimības procesiem AD garozā, tostarp tiem, kas notiek agrīnā asimptomātiskā stadijā.
Lai labāk analizētu paneļa proteīnu maiņas virzienu smadzenēs un mugurkaula šķidrumā, katram no 15 pārklājošajiem moduļiem mēs uzzīmējām sekojošo: (i) atradām moduļa pārpilnības līmeni smadzeņu datu kopā un (ii) moduli. proteīns Atšķirība ir izteikta cerebrospinālajā šķidrumā (S5. attēls). Kā minēts iepriekš, WGCNA izmanto, lai noteiktu moduļa pārpilnību vai raksturīgo proteīna vērtību smadzenēs (13). Vulkāna karti izmanto, lai aprakstītu modulāro proteīnu diferenciālo ekspresiju cerebrospinālajā šķidrumā (AD/kontrole). Šie skaitļi parāda, ka trīs no pieciem paneļiem parāda dažādas izteiksmes tendences smadzenēs un mugurkaula šķidrumā. Abi sinapses paneļa moduļi (M1 un M12) parāda AD smadzeņu pārpilnības līmeņa samazināšanos, bet ievērojami pārklājas ar palielinātu proteīnu AD CSF (attēls S5A). Ar neironiem saistītajos moduļos, kas satur metabolomu (M3 un M38), bija līdzīgi smadzeņu un cerebrospinālā šķidruma ekspresijas modeļi, kas ir pretrunīgi (S5E attēls). Asinsvadu panelī bija arī dažādas ekspresijas tendences, lai gan tā moduļi (M6 un M15) bija mēreni palielināti AD smadzenēs un samazinājās slimajā CSF (attēls S5B). Atlikušajos divos paneļos ir lieli glia tīkli, kuru olbaltumvielas tiek konsekventi regulētas abos nodalījumos (S5, C un D attēls).
Lūdzu, ņemiet vērā, ka šīs tendences nav raksturīgas visiem marķieriem šajos paneļos. Piemēram, sinaptiskais panelis ietver vairākus proteīnus, kas ir ievērojami samazināti AD smadzenēs un CSF (attēls S5A). Starp šiem samazināti regulētajiem cerebrospinālā šķidruma marķieriem ir M1 NPTX2 un VGF, kā arī M12 hromogranīns B. Tomēr, neskatoties uz šiem izņēmumiem, lielākajai daļai mūsu sinaptisko marķieru AD mugurkaula šķidrumā ir paaugstināts līmenis. Kopumā šīs analīzes spēja atšķirt statistiski nozīmīgas smadzeņu un cerebrospinālā šķidruma līmeņa tendences katrā no mūsu pieciem paneļiem. Šīs tendences izceļ sarežģītās un bieži vien atšķirīgās attiecības starp smadzeņu un CSF olbaltumvielu ekspresiju AD.
Pēc tam mēs izmantojām augstas caurlaidības MS replikācijas analīzi (CSF replikācija 1), lai sašaurinātu mūsu 271 biomarķieru kopu līdz daudzsološākajiem un reproducējamākajiem mērķiem (5.A attēls). CSF 1. kopijā kopumā ir 96 paraugi no Emory Goizueta ADRC, ieskaitot kontroli, AsymAD un AD kohortu (S1A tabula). Šiem AD gadījumiem ir raksturīga viegla kognitīvā pasliktināšanās (vidējais MoCA, 20,0 ± 3,8) un AD biomarķieru izmaiņas, kas apstiprinātas cerebrospinālajā šķidrumā (S1A tabula). Pretēji mūsu konstatētajai CSF analīzei, šī replikācija tiek veikta, izmantojot efektīvāku un jaudīgāku “vienreizēja kadra” MS metodi (bez off-line frakcionēšanas), tostarp vienkāršotu paraugu sagatavošanas protokolu, kas novērš nepieciešamību pēc atsevišķu paraugu imūndeficīta. . Tā vietā, lai pastiprinātu mazāk bagātīgu proteīnu signālu, tiek izmantots viens ar vāju imūnsistēmu novājinātu “uzlabošanas kanālu” (37). Lai gan tā samazina kopējo proteomu pārklājumu, šī viena šāviena metode ievērojami samazina mašīnas laiku un palielina ar TMT iezīmēto paraugu skaitu, kurus var analizēt dzīvotspējīgus (17, 38). Kopumā analīzē tika identificēti 6487 peptīdi, kas 96 gadījumos tika saistīti ar 1183 proteomiem. Tāpat kā ar CSF analīzi, ko mēs atklājām, turpmākajos aprēķinos tika iekļauti tikai tie proteīni, kas kvantitatīvi tika noteikti vismaz 50% paraugu, un dati tika regresēti attiecībā uz vecuma un dzimuma ietekmi. Tas noveda pie 792 proteomu galīgās kvantitatīvās noteikšanas, no kurām 95% tika identificēti arī atrastajā CSF datu kopā.
(A) Ar smadzenēm saistīti CSF proteīnu mērķi, kas pārbaudīti pirmajā atkārtotajā CSF grupā un iekļauti pēdējā panelī (n = 60). (B līdz E) Paneļa biomarķieru līmeņi (saliktie z rādītāji), kas mērīti četrās CSF replikācijas grupās. Lai novērtētu pārpilnības izmaiņu statistisko nozīmīgumu katrā atkārtojuma analīzē, tika izmantoti sapārotie t testi vai ANOVA ar Tukey pēckorekciju. CT, kontrole.
Tā kā mēs esam īpaši ieinteresēti pārbaudīt mūsu 271 ar smadzenēm saistīto CSF mērķi, izmantojot visaptverošu analīzi, mēs ierobežosim šī atkārtotā proteoma turpmāku pārbaudi ar šiem marķieriem. No šiem 271 proteīniem 100 tika konstatēti CSF replikācijā 1. S6A attēlā parādīta šo 100 pārklājošo marķieru diferenciālā ekspresija starp kontroles un AD replikācijas paraugiem. Sinaptiskie un metabolītu histoni visvairāk palielinās AD, bet asinsvadu proteīni visvairāk samazinās slimības gadījumā. Lielākā daļa no 100 pārklājošajiem marķieriem (n = 70) saglabāja tādu pašu izmaiņu virzienu abās datu kopās (S6B attēls). Šie 70 apstiprinātie ar smadzenēm saistītie CSF marķieri (S2H tabula) lielā mērā atspoguļo iepriekš novērotās paneļa ekspresijas tendences, tas ir, asinsvadu proteīnu pazemināšanos un visu pārējo paneļu augšējo regulēšanu. Tikai 10 no šiem 70 apstiprinātajiem proteīniem parādīja AD pārpilnības izmaiņas, kas bija pretrunā šīm paneļa tendencēm. Lai izveidotu paneli, kas vislabāk atspoguļo smadzeņu un cerebrospinālā šķidruma vispārējo tendenci, mēs izslēdzām šos 10 proteīnus no interesējošā paneļa, kuru beidzot pārbaudījām (5.A attēls). Tāpēc mūsu panelī galu galā ir iekļauti 60 proteīni, kas pārbaudīti divās neatkarīgās CSF AD grupās, izmantojot dažādu paraugu sagatavošanu un MS platformas analīzi. Šo galīgo paneļu z-score izteiksmes diagrammas CSF 1. kopijas kontroles un AD gadījumos apstiprināja paneļa tendenci, kas novērota mūsu atrastajā CSF grupā (5.B attēls).
Starp šiem 60 proteīniem ir molekulas, par kurām zināms, ka tās ir saistītas ar AD, piemēram, osteopontīns (SPP1), kas ir pro-iekaisuma citokīns, kas ir saistīts ar AD daudzos pētījumos (39-41), un GAP43, A sinaptiskais proteīns. kas ir nepārprotami saistīts ar neirodeģenerāciju (42). Vispilnīgāk pārbaudītie proteīni ir marķieri, kas saistīti ar citām neirodeģeneratīvām slimībām, piemēram, ar amiotrofisko laterālo sklerozi (ALS) saistīto superoksīda dismutāzi 1 (SOD1) un ar Parkinsona slimību saistīto dezaharāzi (PARK7). Mēs esam arī pārliecinājušies, ka daudziem citiem marķieriem, piemēram, SMOC1 un ar smadzenēm bagātam membrānas piestiprināšanas signalizācijas proteīnam 1 (BASP1), ir ierobežotas iepriekšējās saites ar neirodeģenerāciju. Ir vērts atzīmēt, ka, ņemot vērā to zemo kopējo daudzumu CSF proteomā, mums ir grūti izmantot šo augstas caurlaidības viena šāviena noteikšanas metodi, lai ticami noteiktu MAPT un dažus citus ar AD saistītus proteīnus (piemēram, NEFL un NRGN). ) ( 43, 44).
Pēc tam mēs pārbaudījām šos 60 prioritāro paneļu marķierus trīs papildu atkārtotās analīzēs. CSF 2. kopijā mēs izmantojām vienu TMT-MS, lai analizētu neatkarīgu 297 kontroles un AD paraugu grupu no Emory Goizueta ADRC (17). CSF replikācija 3 ietvēra pieejamo TMT-MS datu atkārtotu analīzi no 120 kontroles un AD pacientiem no Lozannas, Šveice (45). Mēs atklājām vairāk nekā divas trešdaļas no 60 prioritārajiem marķieriem katrā datu kopā. Lai gan Šveices pētījumā tika izmantotas dažādas MS platformas un TMT kvantitatīvās noteikšanas metodes (45, 46), mēs stingri atkārtojām savas paneļa tendences divās atkārtotās analīzēs (5. attēls, C un D un S2, I un J tabulas). Lai novērtētu mūsu grupas slimības specifiku, mēs izmantojām TMT-MS, lai analizētu ceturto replikācijas datu kopu (CSF replikācija 4), kas ietvēra ne tikai kontroles (n = 18) un AD (n = 17) gadījumus, bet arī PD ( n = 14)), ALS (n = 18) un frontotemporālās demences (FTD) paraugi (n = 11) (S1A tabula). Mēs veiksmīgi kvantitatīvi noteicām gandrīz divas trešdaļas paneļu proteīnu šajā grupā (38 no 60). Šie rezultāti izceļ AD specifiskās izmaiņas visos piecos biomarķieru paneļos (5.E attēls un S2K tabula). Metabolītu grupas pieaugums uzrādīja spēcīgāko AD specifiku, kam sekoja mielinizācijas un glia grupa. Mazākā mērā FTD uzrāda arī pieaugumu starp šiem paneļiem, kas var atspoguļot līdzīgas iespējamās tīkla izmaiņas (17). Turpretim ALS un PD uzrādīja gandrīz tādus pašus mielinizācijas, glia un metabolomu profilus kā kontroles grupai. Kopumā, neskatoties uz atšķirībām paraugu sagatavošanā, MS platformā un TMT kvantitatīvās noteikšanas metodēs, šīs atkārtotās analīzes liecina, ka mūsu prioritārajiem paneļu marķieriem ir ļoti konsekventas AD specifiskas izmaiņas vairāk nekā 500 unikālos CSF paraugos.
AD neirodeģenerācija ir plaši atzīta vairākus gadus pirms kognitīvo simptomu parādīšanās, tāpēc ir steidzami nepieciešami AsymAD biomarķieri (5, 31). Tomēr arvien vairāk pierādījumu liecina, ka AsymAD bioloģija nebūt nav viendabīga, un sarežģītā riska un noturības mijiedarbība izraisa lielas individuālas atšķirības turpmākajā slimības progresēšanā (47). Lai gan to izmanto, lai identificētu AsymAD gadījumus, CSF galveno biomarķieru (Aβ1-42, kopējais tau un p-tau) līmenis nav pierādījis, ka spēj ticami paredzēt, kurš progresēs līdz demencei (4, 7), kas norāda uz vairāk. ir nepieciešams iekļaut holistiskus biomarķieru rīkus, kuru pamatā ir vairāki smadzeņu fizioloģijas aspekti, lai precīzi stratificētu šīs populācijas risku. Tāpēc mēs pēc tam analizējām mūsu AD apstiprināto biomarķieru paneli CSF 1. kopijas AsymAD populācijā. Šie 31 AsymAD gadījumi uzrādīja neparastus biomarķieru pamata līmeņus (Aβ1–42/kopējā tau ELISA attiecība, <5,5) un pilnīgu izziņu (vidējais MoCA, 27,1). ± 2,2) (S1A tabula). Turklāt visiem cilvēkiem ar AsymAD klīniskās demences rādītājs ir 0, kas norāda, ka nav pierādījumu par ikdienas kognitīvās vai funkcionālās veiktspējas samazināšanos.
Vispirms mēs analizējām apstiprināto paneļu līmeņus visos 96 CSF atkārtojumos 1, ieskaitot AsymAD kohortu. Mēs noskaidrojām, ka vairākiem AsymAD grupas paneļiem bija nozīmīgas AD līdzīgas pārpilnības izmaiņas, asinsvadu panelis uzrādīja AsymAD lejupejošu tendenci, bet visi pārējie paneļi uzrādīja augšupejošu tendenci (6.A attēls). Tāpēc visi paneļi uzrādīja ļoti nozīmīgu korelāciju ar ELISA Aβ1-42 un kopējo tau līmeni (6.B attēls). Turpretim korelācija starp grupu un MoCA rezultātu ir salīdzinoši slikta. Viens no pārsteidzošākajiem šo analīžu atklājumiem ir lielais paneļu pārpilnības klāsts AsymAD kohortā. Kā parādīts 6.A attēlā, AsymAD grupas paneļa līmenis parasti šķērso kontroles grupas un AD grupas paneļa līmeni, parādot salīdzinoši lielu mainīgumu. Lai turpinātu izpētīt šo AsymAD neviendabīgumu, mēs izmantojām daudzdimensiju mērogošanas (MDS) analīzi 96 CSF replikācijas 1 gadījumiem. MDS analīze ļauj vizualizēt gadījumu līdzību, pamatojoties uz noteiktiem mainīgajiem datu kopā. Šai klasteru analīzei mēs izmantojam tikai tos apstiprinātos paneļa marķierus, kuriem ir statistiski nozīmīgas izmaiņas (P <0,05, AD/kontrole) CSF atklāšanas un replikācijas 1. proteomā (n = 29) (S2L tabula). Šī analīze radīja skaidru telpisku klasterizāciju starp mūsu kontroles un AD gadījumiem (6.C attēls). Turpretim daži AsymAD gadījumi ir skaidri sagrupēti kontroles grupā, bet citi atrodas AD gadījumos. Lai turpinātu izpētīt šo AsymAD neviendabīgumu, mēs izmantojām savu MDS karti, lai definētu divas šo AsymAD gadījumu grupas. Pirmajā grupā bija AsymAD gadījumi, kas bija grupēti tuvāk kontrolei (n = 19), savukārt otrajā grupā bija AsymAD gadījumi ar marķiera profilu, kas bija tuvāk AD (n = 12).
(A) CSF biomarķieru grupas ekspresijas līmenis (z-score) visos 96 paraugos CSF replikācijas 1. kohortā, ieskaitot AsymAD. Lai novērtētu paneļu pārpilnības izmaiņu statistisko nozīmīgumu, tika izmantota dispersijas analīze ar Tukey pēckorekciju. (B) paneļa proteīna pārpilnības līmeņa (z-score) korelācijas analīze ar MoCA punktu skaitu un kopējo tau līmeni ELISA Aβ1-42 un CSF kopijas 1 paraugos. Tiek parādīts Pīrsona korelācijas koeficients ar attiecīgo P vērtību. (C) MDS 96 CSF 1. kopijas gadījumiem tika balstīta uz 29 apstiprinātu paneļa marķieru pārpilnības līmeņiem, kas tika būtiski mainīti gan atklāšanas, gan CSF 1. kopijas datu kopās [P <0,05 AD/kontrole (CT)]. Šī analīze tika izmantota, lai sadalītu AsymAD grupu kontroles (n = 19) un AD (n = 12) apakšgrupās. (D) Vulkāna diagramma parāda visu CSF replikācijas 1 proteīnu diferenciālo ekspresiju ar log2 reizes izmaiņām (x ass) attiecībā pret -log10 statistisko P vērtību starp abām AsymAD apakšgrupām. Paneļa biomarķieri ir krāsaini. (E) Atlases grupas biomarķieru CSF replikācijas 1 pārpilnības līmenis ir atšķirīgi izteikts starp AsymAD apakšgrupām. Lai novērtētu statistisko nozīmīgumu, tika izmantota Tukey pēckoriģētā dispersijas analīze.
Mēs pārbaudījām atšķirīgo olbaltumvielu ekspresiju starp šiem kontroles un AD līdzīgajiem AsymAD gadījumiem (6.D attēls un S2L tabula). Iegūtā vulkānu karte parāda, ka starp abām grupām ir būtiski mainījušies 14 paneļu marķieri. Lielākā daļa no šiem marķieriem ir sinapses un metaboloma locekļi. Tomēr šai grupai pieder arī SOD1 un ar miristoilēts ar alanīnu bagātais proteīnkināzes C substrāts (MARCKS), kas ir attiecīgi mielīna un glia imūno grupu locekļi (6. attēls, D un E). Asinsvadu panelī bija arī divi marķieri, kas bija ievērojami samazināti AD līdzīgajā AsymAD grupā, tostarp AE saistošais proteīns 1 (AEBP1) un komplementa ģimenes loceklis C9. Nebija būtiskas atšķirības starp kontroles un AD līdzīgās AsymAD apakšgrupām ELISA AB1-42 (P = 0,38) un p-tau (P = 0,28), taču patiešām bija būtiska atšķirība kopējā tau līmenī (P = 0,0031). ) (S7. attēls). Ir vairāki paneļu marķieri, kas norāda, ka izmaiņas starp abām AsymAD apakšgrupām ir nozīmīgākas nekā kopējais tau līmenis (piemēram, YWHAZ, SOD1 un MDH1) (6E attēls). Kopumā šie rezultāti liecina, ka mūsu apstiprinātajā panelī var būt biomarķieri, kas var apakšgrupēt un potenciālo risku stratificēt pacientus ar asimptomātisku slimību.
Steidzami ir nepieciešami uz sistēmu balstīti biomarķieru rīki, lai labāk izmērītu un mērķētu uz dažādām AD patofizioloģijām. Paredzams, ka šie rīki ne tikai mainīs mūsu AD diagnostikas sistēmu, bet arī veicinās efektīvu, pacientam specifisku ārstēšanas stratēģiju pieņemšanu (1, 2). Šim nolūkam mēs izmantojām objektīvu visaptverošu proteomikas pieeju AD smadzenēm un CSF, lai identificētu tīmekļa CSF biomarķierus, kas atspoguļo plašu smadzeņu patofizioloģiju. Mūsu analīze radīja piecus CSF biomarķieru paneļus, kas (i) atspoguļo sinapses, asinsvadus, mielīnu, imūnsistēmas un vielmaiņas disfunkciju; ii) demonstrē spēcīgu reproducējamību dažādās MS platformās; (iii) Parādiet progresējošas slimībai specifiskas izmaiņas AD agrīnajā un vēlīnā stadijā. Kopumā šie atklājumi ir daudzsološs solis ceļā uz daudzveidīgu, uzticamu, uz tīmekli orientētu biomarķieru rīku izstrādi AD pētījumiem un klīniskiem lietojumiem.
Mūsu rezultāti parāda ļoti konservētu AD smadzeņu tīkla proteoma organizāciju un atbalsta tā izmantošanu kā enkuru uz sistēmu balstītai biomarķieru izstrādei. Mūsu analīze rāda, ka divām neatkarīgām TMT-MS datu kopām, kas satur AD un AsymAD smadzenes, ir spēcīga modularitāte. Šie atklājumi paplašina mūsu iepriekšējo darbu, parādot vairāk nekā 2000 smadzeņu audu jaudīgo moduļu saglabāšanu no vairākām neatkarīgām grupām frontālajā, parietālajā un laika garozā (17). Šis vienprātības tīkls atspoguļo dažādas ar slimībām saistītas izmaiņas, kas novērotas pašreizējos pētījumos, tostarp ar glialiem bagātu iekaisuma moduļu palielināšanos un ar neironiem bagātu moduļu samazināšanos. Tāpat kā pašreizējie pētījumi, šim liela mēroga tīklam ir arī būtiskas modulāras izmaiņas AsymAD, parādot dažādas preklīniskās patofizioloģijas (17).
Tomēr šajā ļoti konservatīvajā uz sistēmu balstītajā sistēmā ir lielāka smalkgraudaina bioloģiskā neviendabība, īpaši starp indivīdiem AD agrīnā stadijā. Mūsu biomarķieru panelis spēj attēlot divas AsymAD apakšgrupas, kas parāda vairāku CSF marķieru ievērojamo atšķirīgo izpausmi. Mūsu grupa spēja izcelt bioloģiskās atšķirības starp šīm divām apakšgrupām, kas nebija acīmredzamas galveno AD biomarķieru līmenī. Salīdzinot ar kontroles grupu, šo AsymAD indivīdu Aβ1-42 / kopējā tau attiecība bija neparasti zema. Tomēr tikai kopējais tau līmenis bija ievērojami atšķirīgs starp abām AsymAD apakšgrupām, savukārt Aβ1-42 un p-tau līmenis palika salīdzinoši salīdzināms. Tā kā šķiet, ka augsts CSF tau ir labāks kognitīvo simptomu prognozētājs nekā Aβ1-42 līmenis (7), mums ir aizdomas, ka abām AsymAD kohortām var būt atšķirīgs slimības progresēšanas risks. Ņemot vērā mūsu AsymAD ierobežoto izlases lielumu un garengriezuma datu trūkumu, ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai pārliecinoši izdarītu šos secinājumus. Tomēr šie rezultāti liecina, ka uz sistēmu balstīts CSF panelis var uzlabot mūsu spēju efektīvi stratificēt indivīdus slimības asimptomātiskā stadijā.
Kopumā mūsu atklājumi atbalsta vairāku bioloģisko funkciju lomu AD patoģenēzē. Tomēr neregulēta enerģijas metabolisms kļuva par visu mūsu piecu apstiprināto marķēšanas paneļu galveno tēmu. Metaboliskie proteīni, piemēram, hipoksantīna-guanīna fosforiboziltransferāze 1 (HPRT1) un laktāta dehidrogenāze A (LDHA), ir visstingrāk apstiprinātie sinaptiskie biomarķieri, kas norāda, ka AD CSF pieaugums ir ļoti reproducējams dzimums. Mūsu asinsvadi un glia paneļi satur arī vairākus marķierus, kas iesaistīti oksidatīvo vielu metabolismā. Šie atklājumi atbilst vielmaiņas procesu galvenajai lomai visās smadzenēs, ne tikai lai apmierinātu neironu lielo enerģijas pieprasījumu, bet arī lai apmierinātu astrocītu un citu glia šūnu lielo enerģijas pieprasījumu (17, 48). Mūsu rezultāti apstiprina arvien vairāk pierādījumu tam, ka redokspotenciāla izmaiņas un enerģijas ceļu pārtraukumi var būt galvenā saikne starp vairākiem galvenajiem procesiem, kas saistīti ar AD patoģenēzi, tostarp mitohondriju traucējumiem, glia izraisītu iekaisumu un asinsvadu bojājumiem (49). Turklāt vielmaiņas cerebrospinālā šķidruma biomarķieri satur lielu skaitu atšķirīgi bagātu proteīnu starp mūsu kontroles un AD līdzīgajām AsymAD apakšgrupām, kas liecina, ka šo enerģijas un redoksu ceļu pārtraukšana var būt kritiska slimības preklīniskajā stadijā .
Mūsu novērotajām dažādajām smadzeņu un cerebrospinālā šķidruma paneļu tendencēm ir arī interesantas bioloģiskas sekas. Ar neironiem bagātās sinapses un metabolomi parāda pazeminātu līmeni AD smadzenēs un palielinātu cerebrospinālā šķidruma daudzumu. Ņemot vērā, ka neironi sinapsēs ir bagāti ar enerģiju ražojošiem mitohondrijiem, lai nodrošinātu enerģiju daudzajiem specializētajiem signāliem (50), ir sagaidāma šo divu neironu grupu ekspresijas profilu līdzība. Neironu zudums un bojāto šūnu ekstrūzija var izskaidrot šīs smadzeņu un CSF paneļu tendences vēlākās slimībās, taču tās nevar izskaidrot agrīnās paneļa izmaiņas, kuras mēs novērojam (13). Viens no iespējamiem skaidrojumiem šiem atklājumiem agrīnas asimptomātiskas slimības gadījumā ir patoloģiska sinaptiskā atzarošana. Jauni pierādījumi peļu modeļos liecina, ka mikroglia mediētā sinaptiskā fagocitoze var tikt patoloģiski aktivizēta AD gadījumā un izraisīt agrīnu sinapses zudumu smadzenēs (51). Šis izmestais sinaptiskais materiāls var uzkrāties CSF, tāpēc mēs novērojam CSF pieaugumu neironu panelī. Ar imūnsistēmu saistīta sinaptiskā atzarošana var arī daļēji izskaidrot glia proteīnu pieaugumu, ko novērojam smadzenēs un cerebrospinālajā šķidrumā visā slimības procesā. Papildus sinaptiskajai atzarošanai vispārējās anomālijas eksocītiskajā ceļā var izraisīt arī dažādas neironu marķieru smadzeņu un CSF izpausmes. Vairāki pētījumi ir parādījuši, ka AD smadzeņu patoģenēzē ir mainījies eksosomu saturs (52). Aβ proliferācijā ir iesaistīts arī ārpusšūnu ceļš (53, 54). Ir vērts atzīmēt, ka eksosomālās sekrēcijas nomākšana var samazināt AD līdzīgu patoloģiju AD transgēno peļu modeļos (55).
Tajā pašā laikā proteīns asinsvadu panelī uzrādīja mērenu AD smadzeņu pieaugumu, bet ievērojami samazinājās CSF. Asins-smadzeņu barjeras (BBB) disfunkcija daļēji var izskaidrot šos atklājumus. Daudzi neatkarīgi pēcnāves pētījumi ar cilvēkiem ir pierādījuši BBB sadalījumu AD (56, 57). Šie pētījumi apstiprināja dažādas patoloģiskas aktivitātes ap šo cieši noslēgto endotēlija šūnu slāni, tostarp smadzeņu kapilāru noplūdi un ar asinīm pārnestu proteīnu perivaskulāru uzkrāšanos (57). Tas var sniegt vienkāršu skaidrojumu par paaugstinātu asinsvadu proteīnu līmeni smadzenēs, taču tas nevar pilnībā izskaidrot šo pašu proteīnu izsīkumu cerebrospinālajā šķidrumā. Viena iespēja ir tāda, ka centrālā nervu sistēma aktīvi izolē šīs molekulas, lai atrisinātu paaugstināta iekaisuma un oksidatīvā stresa problēmu. Dažu vissmagāko CSF proteīnu samazināšanās šajā panelī, īpaši tiem, kas iesaistīti lipoproteīnu regulēšanā, ir saistīta ar kaitīga iekaisuma līmeņa kavēšanu un reaktīvo skābekļa sugu neiroprotektīvo procesu. Tas attiecas uz paroksonāzi 1 (PON1), lipoproteīnus saistošu enzīmu, kas ir atbildīgs par oksidatīvā stresa līmeņa samazināšanu asinsritē (58, 59). Alfa-1-mikroglobulīna/bikunīna prekursors (AMBP) ir vēl viens ievērojami samazināts asinsvadu grupas marķieris. Tas ir lipīdu transportētāja bikunīna prekursors, kas ir iesaistīts arī iekaisuma nomākšanā un neiroloģiskā aizsardzībā (60, 61).
Neskatoties uz dažādām interesantām hipotēzēm, nespēja tieši noteikt bioķīmisko slimību mehānismus ir labi zināms uz atklājumiem balstītas proteomikas analīzes ierobežojums. Tāpēc ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai pārliecinoši definētu mehānismus aiz šiem biomarķieru paneļiem. Lai virzītos uz MS balstītas klīniskās analīzes attīstību, nākotnes virziens paredz arī mērķtiecīgu kvantitatīvu metožu izmantošanu liela mēroga biomarķieru verifikācijai, piemēram, selektīvu vai paralēlu reakciju uzraudzību (62). Mēs nesen izmantojām paralēlu reakciju uzraudzību (63), lai apstiprinātu daudzas šeit aprakstītās CSF olbaltumvielu izmaiņas. Vairāki prioritārie paneļu mērķi ir kvantificēti ar ievērojamu precizitāti, tostarp YWHAZ, ALDOA un SMOC1, kas attiecīgi atbilst mūsu sinapses, vielmaiņas un iekaisuma paneļiem (63). Mērķa pārbaudei var būt noderīga arī neatkarīga datu iegūšana (DIA) un citas uz MS balstītas stratēģijas. Bud et al. (64) Nesen tika pierādīts, ka mūsu CSF atklāšanas datu kopā identificētie AD biomarķieri un neatkarīgā DIA-MS datu kopa, kas sastāv no gandrīz 200 CSF paraugiem no trim dažādām Eiropas kohortām, ievērojami pārklājas. Šie nesenie pētījumi atbalsta mūsu paneļu potenciālu pārveidoties par uzticamu uz MS balstītu noteikšanu. Tradicionālā antivielu un aptamēru noteikšana ir svarīga arī galveno AD biomarķieru tālākai attīstībai. CSF mazā daudzuma dēļ ir grūtāk noteikt šos biomarķierus, izmantojot augstas caurlaidības MS metodes. NEFL un NRGN ir divi šādi zema daudzuma CSF biomarķieru piemēri, kas mūsu visaptverošajā analīzē ir kartēti ar paneli, taču tos nevar droši noteikt, izmantojot mūsu vienoto MS stratēģiju. Mērķa stratēģijas, kuru pamatā ir vairākas antivielas, piemēram, PEA, var veicināt šo marķieru klīnisko transformāciju.
Kopumā šis pētījums nodrošina unikālu proteomikas pieeju CSF AD biomarķieru identificēšanai un pārbaudei, pamatojoties uz dažādām sistēmām. Šo marķieru paneļu optimizēšana papildu AD grupās un MS platformās var izrādīties daudzsološa, lai veicinātu AD riska stratifikāciju un ārstēšanu. Pētījumi, kas novērtē šo paneļu garenvirziena līmeni laika gaitā, ir arī būtiski, lai noteiktu, kura marķieru kombinācija vislabāk stratificē agrīnas slimības risku un slimības smaguma izmaiņas.
Izņemot 3 CSF nokopētos paraugus, visi šajā pētījumā izmantotie CSF paraugi tika savākti Emory ADRC vai cieši saistītu pētniecības iestāžu aizgādībā. Šajos proteomikas pētījumos tika izmantoti pavisam četri Emory CSF paraugu komplekti. Tika konstatēts, ka CSF kohortā ir paraugi no 20 veselām kontrolēm un 20 AD pacientiem. CSF 1. kopijā ir iekļauti paraugi no 32 veselām kontrolēm, 31 AsymAD indivīdam un 33 AD indivīdiem. CSF 2. kopijā ir 147 kontroles un 150 AD paraugi. Vairāku slimību CSF replikācijas 4. kohortā bija 18 kontroles, 17 AD, 19 ALS, 13 PD un 11 FTD paraugi. Saskaņā ar Emory universitātes Institucionālās pārskata padomes apstiprināto vienošanos visi Emory pētījuma dalībnieki saņēma informētu piekrišanu. Saskaņā ar 2014. gada Nacionālā novecošanas institūta paraugprakses vadlīnijām Alcheimera centriem (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) cerebrospinālais šķidrums tika savākts un uzglabāts ar jostas punkciju. Kontroles un AsymAD un AD pacienti saņēma standartizētu kognitīvo novērtējumu Emory Kognitīvās neiroloģijas klīnikā vai Goizueta ADRC. Viņu cerebrospinālā šķidruma paraugus pārbaudīja ar INNO-BIA AlzBio3 Luminex ELISA Aβ1-42, kopējās tau un p-tau analīzei (65). ELISA vērtības tiek izmantotas, lai atbalstītu subjektu diagnostisko klasifikāciju, pamatojoties uz noteiktajiem AD biomarķiera robežkritērijiem (66, 67). Demogrāfiskie un diagnostikas pamatdati citām CSF diagnozēm (FTD, ALS un PD) tiek iegūti arī no Emory ADRC vai saistītām pētniecības iestādēm. Kopsavilkuma gadījumu metadati šiem Emory CSF gadījumiem ir atrodami S1A tabulā. Šveices CSF replikācijas 3. kohortas raksturojums ir publicēts iepriekš (45).
CSF atrada paraugu. Lai palielinātu CSF datu kopas atklāšanas dziļumu, pirms tripsinizācijas tika veikts liela daudzuma proteīnu patēriņš. Īsāk sakot, 130 μl CSF no 40 atsevišķiem CSF paraugiem un vienāds tilpums (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) tika ievietoti centrifūgas kolonnā (Thermo Fisher Scientific, A89868) istabā. temperatūra Inkubēt). Pēc 15 minūšu vērpšanas centrifugējiet paraugu pie 1000 g 2 minūtes. 3K ultracentrbēdzes filtra ierīce (Millipore, UFC500396) tika izmantota, lai koncentrētu notekūdeņu paraugu, centrifugējot pie 14 000 g 30 minūtes. Visus paraugu tilpumus atšķaida līdz 75 μl ar fosfātu buferšķīdumu. Olbaltumvielu koncentrācija tika novērtēta ar bicinhonīnskābes (BCA) metodi saskaņā ar ražotāja protokolu (Thermo Fisher Scientific). Imūndeficīts CSF (60 μl) no visiem 40 paraugiem tika sagremots ar lizilendopeptidāzi (LysC) un tripsīnu. Īsāk sakot, paraugs tika reducēts un alkilēts ar 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboksietil)-fosfīna un 3 μl 0,8 M hloracetamīda 90 ° C temperatūrā 10 minūtes, un pēc tam 15 minūtes tika apstrādāts ar ultraskaņu ūdens vannā. Paraugu atšķaidīja ar 193 μl 8 M urīnvielas buferšķīduma [8 M urīnvielas un 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] līdz galīgajai koncentrācijai 6 M urīnvielas. LysC (4,5 μg; Wako) izmanto šķelšanai uz nakti istabas temperatūrā. Pēc tam paraugu atšķaidīja līdz 1 M urīnvielai ar 50 mM amonija bikarbonātu (ABC) (68). Pievienojiet vienādu daudzumu (4,5 μg) tripsīna (Promega) un pēc tam inkubējiet paraugu 12 stundas. Paskābiniet sagremoto peptīda šķīdumu līdz 1% skudrskābes (FA) un 0,1% trifluoretiķskābes (TFA) galīgajai koncentrācijai (66), un pēc tam atsāliniet ar 50 mg Sep-Pak C18 kolonnu (Waters), kā aprakstīts iepriekš (25). . Pēc tam peptīds tika eluēts 1 ml 50% acetonitrila (ACN). Lai standartizētu olbaltumvielu kvantitatīvo noteikšanu partijās (25), 100 μl alikvotas no visiem 40 CSF paraugiem tika apvienotas, lai iegūtu jauktu paraugu, kas pēc tam tika sadalīts piecos globālā iekšējā standarta (GIS) (48) paraugos. Visi atsevišķie paraugi un kombinētie standarti tiek žāvēti ar ātrgaitas vakuumu (Labconco).
CSF kopē paraugu. Dayon un kolēģi iepriekš ir aprakstījuši imūnsistēmas samazināšanos un CSF kopijas 3 paraugu gremošanu (45, 46). Atlikušie atkārtotie paraugi nebija individuāli noplicināti. Sagremot šos neizņemtos paraugus tripsīnā, kā aprakstīts iepriekš (17). Katrai atkārtotai analīzei 120 μl eluētā peptīda alikvotas no katra parauga tika apvienotas un sadalītas vienāda tilpuma alikvotās daļās, lai izmantotu kā ar TMT iezīmētu globālo iekšējo standartu (48). Visi atsevišķie paraugi un kombinētie standarti tiek žāvēti ar ātrgaitas vakuumu (Labconco). Lai uzlabotu zema daudzuma CSF proteīna signālu, apvienojot 125 μl no katra parauga, katrai atkārtotai analīzei tika sagatavots “uzlabots” paraugs [ti, bioloģiskais paraugs, kas atdarina pētāmo paraugu, bet pieejamais daudzums ir daudz lielāks (37, 69)] apvienojās jauktā CSF paraugā (17). Pēc tam jauktais paraugs tika imunizēti noņemts, izmantojot 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), sagremots, kā aprakstīts iepriekš, un iekļauts turpmākajā daudzkārtējā TMT marķējumā.
Publicēšanas laiks: 27. augusts 2021