Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Termofīli ir mikroorganismi, kas plaukst augstā temperatūrā. To izpēte var sniegt vērtīgu informāciju par to, kā dzīve pielāgojas ekstremāliem apstākļiem. Tomēr ar parastajiem optiskajiem mikroskopiem ir grūti sasniegt augstas temperatūras apstākļus. Ir piedāvāti vairāki paštaisīti risinājumi, kuru pamatā ir lokālā pretestības elektriskā apkure, taču vienkārša komerciāla risinājuma nav. Šajā rakstā mēs iepazīstinām ar mikroskopiskā lāzera sildīšanas koncepciju virs mikroskopa redzes lauka, lai nodrošinātu augstu temperatūru termofīlo pētījumu veikšanai, vienlaikus saglabājot maigu lietotāja vidi. Mikroskalu sildīšanu ar mērenu lāzera intensitāti var panākt, izmantojot zelta nanodaļiņām pārklātu substrātu kā bioloģiski saderīgu un efektīvu gaismas absorbētāju. Tiek apspriestas mikromēroga šķidruma konvekcijas, šūnu aiztures un centrbēdzes termoforētiskās kustības iespējamās sekas. Metode ir pierādīta ar divām sugām: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktīva termofīla baktērija, kas vairojas aptuveni 65°C temperatūrā un kuras, kā esam novērojuši, dīgst, augt un peldot mikromērogā karsējot; (ii) Thiobacillus sp., optimāli hipertermofīla arheja. 80°C temperatūrā. Šis darbs paver ceļu vienkāršai un drošai termofīlo mikroorganismu novērošanai, izmantojot modernus un pieejamus mikroskopijas rīkus.
Miljardiem gadu dzīvība uz Zemes ir attīstījusies, lai pielāgotos dažādiem vides apstākļiem, kas dažkārt tiek uzskatīti par ekstrēmiem no mūsu cilvēka perspektīvas. Jo īpaši daži termofīli mikroorganismi (baktērijas, arhejas, sēnītes), ko sauc par termofiliem, plaukst temperatūras diapazonā no 45°C līdz 122°C1, 2, 3, 4. Termofīli dzīvo dažādās ekosistēmās, piemēram, dziļjūras hidrotermālās atverēs, karstajos avotos. vai vulkāniskās zonas. Viņu pētījumi pēdējo desmitgažu laikā ir radījuši lielu interesi vismaz divu iemeslu dēļ. Pirmkārt, mēs varam mācīties no tiem, piemēram, kā termofīli 5, 6, fermenti 7, 8 un membrānas 9 ir stabili tik augstās temperatūrās vai kā termofīli var izturēt ārkārtēju starojuma līmeni10. Otrkārt, tie ir pamats daudziem svarīgiem biotehnoloģijas lietojumiem1, 11, 12, piemēram, degvielas ražošanai13, 14, 15, 16, ķīmiskajai sintēzei (dihidro, spirti, metāns, aminoskābes utt.)17, bioieguve18 un termostabilie biokatalizatori7,11, 13. Jo īpaši pašlaik labi zināmā polimerāzes ķēdes reakcija (PCR)19 ietver fermentu (Taq polimerāzi), kas izolēts no termofīlās baktērijas Thermus aquaticus, kas ir viens no pirmajiem atklātajiem termofiliem.
Tomēr termofilu izpēte nav viegls uzdevums, un to nevar improvizēt nevienā bioloģiskajā laboratorijā. Jo īpaši dzīvos termofilus nevar novērot in vitro ar standarta gaismas mikroskopu, pat ar komerciāli pieejamām sildīšanas kamerām, kuras parasti ir paredzētas līdz 40 °C temperatūrai. Kopš 1990. gadiem tikai dažas pētniecības grupas ir veltījušas sevi augstas temperatūras mikroskopijas (HTM) sistēmu ieviešanai. 1994. gadā Glukh et al. Sildīšanas/dzesēšanas kamera tika izstrādāta, pamatojoties uz Peltjē elementu, kas kontrolē taisnstūrveida kapilāru temperatūru, kas ir slēgta, lai saglabātu anaerobitāti 20 . Ierīci var uzkarsēt līdz 100 °C ar ātrumu 2 °C/s, ļaujot autoriem izpētīt hipertermofīlās baktērijas Thermotoga maritima21 kustīgumu. 1999. gadā Horns et al. Ir izstrādāta ļoti līdzīga ierīce, kas joprojām balstās uz komerciālai mikroskopijai piemērotu apsildāmu kapilāru izmantošanu, lai pētītu šūnu dalīšanos/savienojumu. Pēc ilga relatīvas neaktivitātes perioda 2012. gadā tika atsākta efektīvu HTM meklēšana, jo īpaši saistībā ar Wirth grupas dokumentu sēriju, kurā tika izmantota Horna u.c. izgudrotā ierīce. Pirms piecpadsmit gadiem liela skaita arheju, tostarp hipertermofīlu, kustīgums tika pētīts temperatūrā līdz 100 ° C, izmantojot apsildāmus kapilārus23,24. Viņi arī modificēja sākotnējo mikroskopu, lai panāktu ātrāku karsēšanu (vairākas minūtes, nevis 35 minūtes, lai sasniegtu iestatīto temperatūru) un sasniegtu lineāro temperatūras gradientu, kas pārsniedz 2 cm visā vidē. Šī temperatūras gradienta veidošanas ierīce (TGFD) ir izmantota, lai pētītu daudzu termofilu mobilitāti temperatūras gradientos bioloģiski nozīmīgos attālumos 24, 25 .
Slēgto kapilāru sildīšana nav vienīgais veids, kā novērot dzīvus termofilus. 2012. gadā Kuwabara u.c. Tika izmantotas paštaisītas vienreizējās lietošanas Pyrex kameras, kas noslēgtas ar karstumizturīgu līmi (Super X2; Cemedine, Japāna). Paraugi tika novietoti uz komerciāli pieejamas caurspīdīgas sildīšanas plāksnes (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japāna), kas spēj uzkarst līdz 110 ° C, bet sākotnēji nebija paredzēta bioattēlveidošanai. Autori novēroja efektīvu anaerobo termofīlo baktēriju (Thermosipho globiformans, dubultošanās laiks 24 min) sadalīšanos 65°C temperatūrā. 2020. gadā Pulshen et al. Komerciālo metāla trauku (AttofluorTM, Thermofisher) efektīva karsēšana tika demonstrēta, izmantojot divus paštaisītus sildelementus: vāku un skatuvi (PCR mašīnas iedvesmota konfigurācija). Šī asociācija nodrošina vienmērīgu šķidruma temperatūru un novērš iztvaikošanu un kondensāciju vāka apakšā. Izmantojot O veida gredzenu, tiek novērsta gāzes apmaiņa ar vidi. Šis HTM, ko sauc par Sulfoskopu, tika izmantots, lai attēlotu Sulfolobus acidocaldarius 75°C27 temperatūrā.
Atzīts visu šo sistēmu ierobežojums bija gaisa objektīvu izmantošanas ierobežojums, jo jebkura eļļas iegremdēšana nebija piemērota tik augstai temperatūrai un attēlveidošanai ar > 1 mm bieziem caurspīdīgiem paraugiem. Atzīts visu šo sistēmu ierobežojums bija gaisa objektīvu izmantošanas ierobežojums, jo jebkura eļļas iegremdēšana nebija piemērota tik augstai temperatūrai un attēlveidošanai ar > 1 mm bieziem caurspīdīgiem paraugiem. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективсков, погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачны через прозрачны Atzīts visu šo sistēmu trūkums bija gaisa objektīvu izmantošanas ierobežojums, jo jebkura eļļas iegremdēšana nebija piemērota tik augstai temperatūrai un vizualizācijai caur caurspīdīgiem paraugiem, kuru biezums ir > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适叹浸都不适吂吂毫米厚的透明样品成像. Atzīts visu šo sistēmu ierobežojums ir ierobežojums izmantot spoguļu ar gaisu, jo jebkura eļļas iegremdēšana nav piemērota caurspīdīgu paraugu, kuru biezums ir lielāks par 1 mm, attēlveidošanai tik augstās temperatūrās. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушорных объвектиморных объектиморных ужение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозмрачные образцы нол1щих нол1щих температур и визуализации через прозмрачные образцы нол1щих температур и визуализации. Atzīts visu šo sistēmu trūkums ir ierobežotā gaisa lēcu izmantošana, jebkura eļļas iegremdēšana nav piemērota tik augstām temperatūrām un vizualizācija caur caurspīdīgiem paraugiem >1 mm biezumā.Pavisam nesen šo ierobežojumu atcēla Charles-Orzag et al. 28, kurš izstrādāja ierīci, kas vairs nenodrošina siltumu ap interesējošo sistēmu, bet gan pašā vāka stikla iekšpusē, kas pārklāts ar plānu caurspīdīgu rezistora slāni, kas izgatavots no ITO (indium-alvas oksīds). Vāku var uzsildīt līdz 75 °C, izlaižot elektrisko strāvu caur caurspīdīgo slāni. Tomēr autoram arī jāuzsilda objektīvs līdz objektīvam, bet ne vairāk kā 65 °C, lai to nesabojātu.
Šie darbi parāda, ka efektīvas augstas temperatūras optiskās mikroskopijas izstrāde nav plaši izmantota, bieži vien ir nepieciešams paštaisīts aprīkojums, un to bieži panāk uz telpiskās izšķirtspējas rēķina, kas ir nopietns trūkums, ņemot vērā to, ka termofīlie mikroorganismi nav lielāki par dažiem. mikrometri. Samazināts sildīšanas apjoms ir atslēga, lai atrisinātu trīs HTM raksturīgās problēmas: slikta telpiskā izšķirtspēja, liela termiskā inerce, sistēmai uzkarstot, un apkārtējo elementu (imersijas eļļas, objektīva… vai lietotāja roku) kaitīga uzkaršana ekstremālās temperatūrās. ).
Šajā rakstā mēs ieviešam HTM termofilu novērošanai, kas nav balstīts uz pretestības sildīšanu. Tā vietā mēs panācām lokālu sildīšanu ierobežotā mikroskopa redzes lauka apgabalā, apstarojot gaismu absorbējošu substrātu. Temperatūras sadalījums tika vizualizēts, izmantojot kvantitatīvo fāzes mikroskopiju (QPM). Šīs metodes efektivitāti pierāda Geobacillus stearothermophilus, kustīga termofīla baktērija, kas vairojas aptuveni 65°C temperatūrā un kurai ir īss dubultošanās laiks (apmēram 20 minūtes), un Sulfolobus shibatae, hipertermofīla baktērija, kas optimāli aug 80°C temperatūrā (archaea). ilustrēt. Normāls replikācijas ātrums un peldēšana tika novērota kā temperatūras funkcija. Šo lāzeru HTM (LA-HTM) neierobežo pārklājuma biezums vai objektīva raksturs (gaisa vai eļļas iegremdēšana). Tas ļauj izmantot jebkuru augstas izšķirtspējas objektīvu tirgū. Tas arī necieš no lēnas karsēšanas termiskās inerces dēļ (panāk tūlītēju uzsilšanu milisekundes mērogā) un izmanto tikai komerciāli pieejamus komponentus. Vienīgās jaunās drošības problēmas ir saistītas ar jaudīgu lāzera staru (parasti līdz 100 mW) klātbūtni ierīces iekšpusē un, iespējams, caur acīm, kam nepieciešamas aizsargbrilles.
LA-HTM princips ir izmantot lāzeru, lai lokāli uzsildītu paraugu mikroskopa redzamības laukā (1.a attēls). Lai to izdarītu, paraugam jābūt gaismu absorbējošam. Lai izmantotu saprātīgu lāzera jaudu (mazāku par 100 mW), mēs nepaļāvāmies uz gaismas absorbciju šķidrajā vidē, bet gan mākslīgi palielinājām parauga absorbciju, pārklājot substrātu ar zelta nanodaļiņām (1.c att.). Zelta nanodaļiņu karsēšana ar gaismu ir ļoti svarīga termiskās plazmonikas jomā, paredzot pielietojumu biomedicīnā, nanoķīmijā vai saules gaismas ieguvē 29, 30, 31. Dažu pēdējo gadu laikā mēs esam izmantojuši šo LA-HTM vairākos pētījumos, kas saistīti ar termiskās plazmas pielietojumu fizikā, ķīmijā un bioloģijā. Šīs metodes galvenās grūtības ir gala temperatūras profila attēlošana, jo paaugstinātā temperatūra ir ierobežota līdz mikromēroga apgabalam paraugā. Mēs esam parādījuši, ka temperatūras kartēšanu var panākt ar četru viļņu garuma šķērseniskās bīdes interferometru, vienkāršu, augstas izšķirtspējas un ļoti jutīgu kvantitatīvās fāzes mikroskopijas metodi, kuras pamatā ir divdimensiju difrakcijas režģu (pazīstami arī kā šķērsrežģi) izmantošana. 33,34,35,36. Šīs termiskās mikroskopijas tehnikas uzticamība, kuras pamatā ir šķērsota režģa viļņu frontes mikroskopija (CGM), ir pierādīta duci pēdējo desmit gadu laikā publicētos rakstos37, 38, 39, 40, 41, 42, 43.
Paralēlā lāzera sildīšanas, formēšanas un temperatūras mikroskopa uzstādīšanas shēma. b Parauga ģeometrija, kas sastāv no AttofluorTM kameras, kurā ir pārklājums, kas pārklāts ar zelta nanodaļiņām. c Uzmanīgi apskatiet paraugu (nevis mērogā). d apzīmē vienmērīgu lāzera stara profilu un (e) simulēto turpmāko temperatūras sadalījumu zelta nanodaļiņu parauga plaknē. f ir gredzenveida lāzera stara profils, kas piemērots vienmērīgas temperatūras ģenerēšanai, kā parādīts iegūtā temperatūras sadalījuma simulācijā, kas parādīta g) apakšpunktā. Mēroga josla: 30 µm.
Jo īpaši mēs nesen panācām zīdītāju šūnu sildīšanu ar LA-HTM un CGM un izsekojām šūnu karstuma šoka reakcijas diapazonā no 37 līdz 42 ° C, parādot šīs metodes pielietojamību vienas dzīvas šūnas attēlveidošanā. Tomēr LA-HTM pielietojums mikroorganismu pētīšanai augstās temperatūrās nav viennozīmīgs, jo tas prasa lielāku piesardzību salīdzinājumā ar zīdītāju šūnām: pirmkārt, barotnes dibena uzsildīšana par desmitiem grādu (nevis dažiem grādiem) noved. līdz spēcīgam vertikālam temperatūras gradientam. var radīt šķidruma konvekciju 44, kas, ja nav stingri piestiprināta pie pamatnes, var izraisīt nevēlamu kustību un baktēriju sajaukšanos. Šo konvekciju var novērst, samazinot šķidruma slāņa biezumu. Šim nolūkam visos tālāk aprakstītajos eksperimentos baktēriju suspensijas tika novietotas starp diviem apmēram 15 µm bieziem segstikliņiem, kas ievietoti metāla kausā (AttofluorTM, Thermofisher, 1.b, c attēls). Principā no konvekcijas var izvairīties, ja šķidruma biezums ir mazāks par sildošā lāzera stara izmēru. Otrkārt, strādājot tik ierobežotā ģeometrijā, var nosmakt aerobos organismus (skat. S2 att.). No šīs problēmas var izvairīties, izmantojot substrātu, kas ir caurlaidīgs skābekli (vai jebkuru citu dzīvībai svarīgu gāzi), atstājot nosprostotus gaisa burbuļus pārklājuma iekšpusē vai urbjot caurumus augšējā pārklājuma stiklā (sk. S1 att.) 45 . Šajā pētījumā mēs izvēlējāmies pēdējo risinājumu (1.b un S1 attēls). Visbeidzot, lāzera apkure nenodrošina vienmērīgu temperatūras sadalījumu. Pat pie tādas pašas lāzera stara intensitātes (1.d att.) temperatūras sadalījums nav vienmērīgs, bet drīzāk atgādina Gausa sadalījumu termiskās difūzijas dēļ (1.e att.). Ja mērķis ir noteikt precīzas temperatūras redzes laukā bioloģisko sistēmu izpētei, nevienmērīgi profili nav ideāli un var izraisīt arī baktēriju termoforētisku kustību, ja tās nepielīp pie substrāta (sk. S3, S4 att.)39. Šim nolūkam mēs izmantojām telpiskās gaismas modulatoru (SLM), lai veidotu infrasarkano lāzera staru atbilstoši gredzena formai (1.f att.) parauga plaknē, lai sasniegtu pilnīgi vienmērīgu temperatūras sadalījumu noteiktā ģeometriskā apgabalā. neskatoties uz termisko difūziju (1.d attēls) 39 , 42, 46. Novietojiet augšējo segstikliņu virs metāla trauka (1.b attēls), lai izvairītos no barotnes iztvaikošanas, un novērojiet vismaz dažas dienas. Tā kā šis augšējais pārklājums nav noslēgts, vajadzības gadījumā jebkurā laikā var viegli pievienot papildu materiālu.
Lai ilustrētu LA-HTM darbību un parādītu tā pielietojamību termofīlajos pētījumos, mēs pētījām aerobās baktērijas Geobacillus stearothermophilus, kuru optimālā augšanas temperatūra ir aptuveni 60-65 °C. Baktērijai ir arī flagellas un spēja peldēt, nodrošinot vēl vienu normālu šūnu aktivitātes rādītāju.
Paraugus (1.b attēls) vienu stundu iepriekš inkubēja 60 °C temperatūrā un pēc tam ievietoja LA-HTM paraugu turētājā. Šī iepriekšēja inkubācija nav obligāta, taču joprojām ir noderīga divu iemeslu dēļ: pirmkārt, kad lāzers ir ieslēgts, tas izraisa šūnu tūlītēju augšanu un dalīšanos (skatiet filmu M1 papildu materiālos). Bez iepriekšējas inkubācijas baktēriju augšana parasti tiek aizkavēta par aptuveni 40 minūtēm katru reizi, kad paraugam tiek uzkarsēts jauns skatīšanās laukums. Otrkārt, 1 stundu ilga iepriekšēja inkubācija veicināja baktēriju adhēziju pie pārklājuma, neļaujot šūnām izkļūt no redzes lauka termoforēzes dēļ, kad lāzers tika ieslēgts (skatiet filmu M2 papildu materiālos). Termoforēze ir daļiņu vai molekulu kustība pa temperatūras gradientu, parasti no karstas uz aukstu, un baktērijas nav izņēmums43,47. Šī nevēlamā ietekme tiek novērsta noteiktā apgabalā, izmantojot SLM, lai veidotu lāzera staru un panāktu vienmērīgu temperatūras sadalījumu.
Uz att. 2. attēlā parādīts temperatūras sadalījums, ko mēra ar CGM, kas iegūts, ar gredzenveida lāzera staru apstarojot stikla substrātu, kas pārklāts ar zelta nanodaļiņām (1.f att.). Tika novērots vienmērīgs temperatūras sadalījums visā lāzera stara aptvertajā zonā. Šī zona tika iestatīta uz 65°C, optimālo augšanas temperatūru. Ārpus šī apgabala temperatūras līkne dabiski samazinās līdz \(1/r\) (kur \(r\) ir radiālā koordināta).
CGM mērījumu temperatūras karte, kas iegūta, izmantojot gredzenveida lāzera staru, lai apstarotu zelta nanodaļiņu slāni, lai iegūtu plakanu temperatūras profilu apļveida laukumā. b Temperatūras kartes izoterma (a). Lāzera stara kontūru attēlo pelēks punktēts aplis. Eksperiments tika atkārtots divas reizes (skatīt Papildu materiālus, S4 attēlu).
Baktēriju šūnu dzīvotspēja tika uzraudzīta vairākas stundas, izmantojot LA-HTM. Uz att. 3 parāda laika intervālu četriem attēliem, kas uzņemti no 3 stundu 20 minūšu filmas (filma M3, papildu informācija). Tika novērots, ka baktērijas aktīvi vairojas lāzera noteiktajā apļveida zonā, kur temperatūra bija optimāla, tuvojoties 65 ° C. Turpretī šūnu augšana tika ievērojami samazināta, kad temperatūra nokritās zem 50 ° C 10 sekundes.
G. stearothermophilus baktēriju optiskā dziļuma attēli, kas aug pēc lāzera karsēšanas dažādos laikos, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, out of 200 Iegūts no vienas minūtes filmas (M3 plēve, kas sniegta papildinformācijā), kas uzlikta uz atbilstošās temperatūras kartes. Lāzers ieslēdzas laikā \(t=0\). Intensitātes attēlam ir pievienotas izotermas.
Lai turpmāk kvantitatīvi noteiktu šūnu augšanu un tās atkarību no temperatūras, mēs izmērījām dažādu sākotnēji izolētu baktēriju koloniju biomasas pieaugumu Movie M3 skata laukā (4. att.). Mācību baktērijas, kas atlasītas mini koloniju veidojošās vienības (mCFU) veidošanās sākumā, ir parādītas S6 attēlā. Sausās masas mērījumi tika veikti ar CGM 48 kameru, ko izmantoja temperatūras sadalījuma kartēšanai. CGM spēja izmērīt sauso svaru un temperatūru ir LA-HTM stiprā puse. Kā gaidīts, augsta temperatūra izraisīja ātrāku baktēriju augšanu (4.a attēls). Kā parādīts daļēji log diagrammā 4.b attēlā, augšana visās temperatūrās seko eksponenciālai izaugsmei, kur dati izmanto eksponenciālo funkciju \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), kur \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) — ģenerēšanas laiks (vai dubultošanas laiks), \( g =1/ \tau\) – pieauguma temps (dalījumu skaits laika vienībā ). Uz att. 4c attēlā parādīts attiecīgais augšanas ātrums un paaudzes laiks kā temperatūras funkcija. Ātri augošiem mCFU raksturo augšanas piesātinājums pēc divām stundām, paredzama uzvedība augsta baktēriju blīvuma dēļ (līdzīgi kā stacionārajai fāzei klasiskajās šķidrajās kultūrās). Vispārējā forma \(g\left(T\right)\) (4.c att.) atbilst sagaidāmajai G. stearothermophilus divu fāžu līknei ar optimālu augšanas ātrumu ap 60-65°C. Saskaņojiet datus, izmantojot kardinālu modeli (S5. attēls)49, kur \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, kas labi saskan ar citām literatūrā minētajām vērtībām49. Lai gan no temperatūras atkarīgie parametri ir reproducējami, maksimālais augšanas ātrums \({G}_{0}\) dažādos eksperimentos var atšķirties (skatiet attēlus S7-S9 un filmu M4). Atšķirībā no temperatūras pielāgošanas parametriem, kuriem jābūt universāliem, maksimālais augšanas ātrums ir atkarīgs no barotnes īpašībām (barības vielu pieejamība, skābekļa koncentrācija) novērotās mikroskalas ģeometrijā.
a Mikrobu augšana dažādās temperatūrās. mCFU: miniatūras kolonijas veidojošās vienības. Dati iegūti no video par vienas baktērijas augšanu temperatūras gradientā (filma M3). b Tāda pati kā (a), daļēji logaritmiskā skala. c Izaugsmes ātrums\(\tau\) un ģenerēšanas laiks\(g\), kas aprēķināts no lineārās regresijas (b). Horizontālās kļūdu joslas: temperatūras diapazons, kurā mCFU augšanas laikā paplašinājās redzes laukā. Vertikālās kļūdu joslas: lineārās regresijas standarta kļūda.
Papildus normālai augšanai dažas baktērijas dažkārt parādījās redzeslokā lāzera sildīšanas laikā, kas ir sagaidāma baktēriju ar flagellas uzvedība. Filma M5 papildinformācijā parāda šādas peldēšanas aktivitātes. Šajā eksperimentā, lai izveidotu temperatūras gradientu, tika izmantots vienmērīgs lāzera starojums, kā parādīts 1d, e un S3 attēlā. 5. attēlā parādītas divas attēlu secības, kas atlasītas no M5 filmas, parādot, ka vienai baktērijai ir virziena kustība, bet visas pārējās baktērijas paliek nekustīgas.
Divi laika periodi (a) un (b) parāda divu dažādu baktēriju peldēšanu, kas apzīmētas ar punktotiem apļiem. Attēli tika iegūti no filmas M5 (nodrošināts kā papildu materiāls).
G. stearothermophilus gadījumā baktēriju aktīvā kustība (5. att.) sākās dažas sekundes pēc lāzera stara ieslēgšanas. Šis novērojums uzsver šī termofīlā mikroorganisma īslaicīgo reakciju uz temperatūras paaugstināšanos, kā jau novēroja Mora et al. 24 . Baktēriju kustīguma un pat termotaksijas tēmu var sīkāk izpētīt, izmantojot LA-HTM.
Mikrobu peldēšanu nevajadzētu jaukt ar citiem fiziskās kustības veidiem, proti, (i) Brauna kustību, kas šķiet haotiska kustība bez noteikta virziena, (ii) konvekcija 50 un termoforēze 43, kas sastāv no regulāras kustības novirzes pa temperatūru. gradients.
G. stearothermophilus ir pazīstama ar spēju radīt ļoti izturīgas sporas (sporu veidošanās), ja tā tiek pakļauta nelabvēlīgiem vides apstākļiem kā aizsardzība. Kad vides apstākļi atkal kļūst labvēlīgi, sporas dīgst, veidojot dzīvas šūnas un atsākot augšanu. Lai gan šis sporulācijas/dīgšanas process ir labi zināms, tas nekad nav novērots reālajā laikā. Izmantojot LA-HTM, mēs šeit ziņojam par pirmo G. stearothermophilus dīgtspējas notikumu novērojumu.
Uz att. 6.a attēlā parādīti optiskā dziļuma (OT) laika intervāla attēli, kas iegūti, izmantojot 13 sporu CGM komplektu. Visā savākšanas laikā (15 h 6 min, \(t=0\) – lāzera karsēšanas sākums) 4 no 13 sporām uzdīguši, secīgos laika punktos \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' un \(11\) h \(30\)'. Lai gan 6. attēlā ir parādīts tikai viens no šiem notikumiem, papildu materiālā M6 filmā var novērot 4 dīgšanas notikumus. Interesanti, ka dīgtspēja šķiet nejauša: ne visas sporas dīgst un nedīgst vienlaikus, neskatoties uz vienādām vides apstākļu izmaiņām.
a Time-lapse, kas sastāv no 8 OT attēliem (eļļas iegremdēšana, 60x, 1,25 NA objektīvs) un (b) G. stearothermophilus agregātu biomasas evolūcija. c (b) zīmēts uz daļēji logaritma skalas, lai izceltu augšanas ātruma linearitāti (pārtraukta līnija).
Uz att. 6b, c attēlo šūnu populāciju biomasu redzes laukā kā laika funkciju visā datu vākšanas periodā. Sausās masas ātra sabrukšana, kas novērota pie \(t=5\)h attēlā. 6b, c, dažu šūnu izejas dēļ no redzes lauka. Šo četru notikumu pieauguma temps ir \(0,77\pm 0,1\) h-1. Šī vērtība ir augstāka par augšanas ātrumu, kas saistīts ar 3. 3. un 4. attēlu, kur šūnas aug normāli. Iemesls palielinātam G. stearothermophilus augšanas ātrumam no sporām nav skaidrs, taču šie mērījumi izceļ LA-HTM interesi un darbojas vienas šūnas līmenī (vai vienas mCFU līmenī), lai uzzinātu vairāk par šūnu dzīves dinamiku. .
Lai vēl vairāk demonstrētu LA-HTM daudzpusību un tā veiktspēju augstās temperatūrās, mēs pārbaudījām Sulfolobus shibatae, hipertermofīlas acidofīlas arhejas augšanu ar optimālo augšanas temperatūru 80 °C51. Salīdzinot ar G. stearothermophilus, šīm arhejām ir arī ļoti atšķirīga morfoloģija, kas drīzāk atgādina 1 mikrona sfēras (kokus), nevis iegarenus stieņus (baciļus).
attēlā. Šis mCFU aug aptuveni 73 °C temperatūrā, kas ir zemāka par optimālo temperatūru 80 °C, bet aktīvas augšanas temperatūras diapazonā. Mēs novērojām vairākus dalīšanās notikumus, kas pēc dažām stundām lika mCFU izskatīties kā arhejas mikrovīnogas. No šiem OT attēliem laika gaitā tika izmērīta mCFU biomasa un parādīta 7.b attēlā. Interesanti, ka S. shibatae mCFU uzrādīja lineāru augšanu, nevis eksponenciālu pieaugumu, kas novērots ar G. stearothermophilus mCFU. Ir notikušas ilgstošas diskusijas52 par šūnu augšanas ātruma būtību: lai gan daži pētījumi ziņo par mikrobu augšanas ātrumu, kas ir proporcionāls to lielumam (eksponenciāls pieaugums), citi liecina par nemainīgu ātrumu (lineāra vai bilineāra augšana). Kā paskaidroja Tzur et al.53, lai atšķirtu eksponenciālo un (bi)lineāro augšanu, biomasas mērījumu precizitāte ir <6%, kas ir nepieejama lielākajai daļai QPM metožu, pat izmantojot interferometriju. Kā paskaidroja Tzur et al.53, lai atšķirtu eksponenciālo un (bi)lineāro augšanu, biomasas mērījumu precizitāte ir <6%, kas ir nepieejama lielākajai daļai QPM metožu, pat izmantojot interferometriju. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точрености <6% точрености ижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Kā skaidro Zur et al.53, lai atšķirtu eksponenciālo un (bi)lineāro augšanu, biomasas mērījumos ir nepieciešama <6% precizitāte, kas nav sasniedzama lielākajai daļai QPM metožu, pat izmantojot interferometriju.Kā paskaidroja Zur et al. 53, lai atšķirtu eksponenciālo un (bi) lineāro augšanu, biomasas mērījumos ir nepieciešama mazāka par 6% precizitāte, kas nav sasniedzama lielākajai daļai QPM metožu, pat ja tiek izmantota interferometrija. CGM sasniedz šo precizitāti ar sub-pg precizitāti biomasas mērījumos36,48.
laika intervāls, kas sastāv no 6 OT attēliem (eļļas iegremdēšana, 60x, NA objektīvs 1,25) un (b) mikro-CFU biomasas evolūcija, kas mērīta ar CGM. Plašāku informāciju skatiet filmā M7.
Pilnīgi lineāra S. shibatae augšana bija negaidīta, un par to vēl nav ziņots. Tomēr ir sagaidāms eksponenciāls pieaugums vismaz tāpēc, ka laika gaitā ir jānotiek vairākām 2, 4, 8, 16 … šūnu dalīšanām. Mēs izvirzījām hipotēzi, ka lineāro augšanu var izraisīt šūnu inhibīcija blīvas šūnu iesaiņojuma dēļ, tāpat kā šūnu augšana palēninās un galu galā sasniedz neaktivizētu stāvokli, kad šūnu blīvums ir pārāk augsts.
Noslēgumā mēs pēc kārtas apspriežam šādus piecus interesējošos punktus: sildīšanas tilpuma samazinājums, termiskās inerces samazināšana, interese par zelta nanodaļiņām, interese par kvantitatīvās fāzes mikroskopiju un iespējamais temperatūras diapazons, kurā var izmantot LA-HTM.
Salīdzinot ar pretestības sildīšanu, HTM izstrādei izmantotā lāzera apkure piedāvā vairākas priekšrocības, kuras mēs ilustrējam šajā pētījumā. Jo īpaši šķidrā vidē mikroskopa redzamības laukā sildīšanas tilpums tiek turēts dažu (10 μm) 3 tilpumu robežās. Tādā veidā aktīvi ir tikai novērotie mikrobi, savukārt citas baktērijas ir pasīvās un var tikt izmantotas tālākai parauga izpētei – nav jāmaina paraugs katru reizi, kad jāpārbauda jauna temperatūra. Turklāt mikromēroga karsēšana ļauj tieši pārbaudīt lielu temperatūru diapazonu: 4.c attēls tika iegūts no 3 stundu filmas (Movie M3), kurā parasti ir jāsagatavo un jāpārbauda vairāki paraugi – viens katram no pētāmajiem paraugiem. y ir temperatūra, kas apzīmē dienu skaitu eksperimentā. Samazinot apsildāmo tilpumu, visas apkārtējās mikroskopa optiskās sastāvdaļas, īpaši objektīva lēca, tiek uzturētas istabas temperatūrā, kas līdz šim ir bijusi galvenā problēma, ar kuru sabiedrība saskaras. LA-HTM var izmantot ar jebkuru objektīvu, ieskaitot eļļas imersijas lēcas, un tas saglabāsies istabas temperatūrā pat ekstremālām temperatūrām redzes laukā. Galvenais lāzera sildīšanas metodes ierobežojums, par kuru mēs ziņojam šajā pētījumā, ir tas, ka šūnas, kas nepielīp vai peld, var būt tālu no redzes lauka un grūti izpētīt. Risinājums varētu būt zema palielinājuma lēcu izmantošana, lai panāktu lielāku temperatūras paaugstināšanos, kas pārsniedz dažus simtus mikronu. Šo piesardzību pavada telpiskās izšķirtspējas samazināšanās, taču, ja mērķis ir pētīt mikroorganismu kustību, liela telpiskā izšķirtspēja nav nepieciešama.
Sistēmas sildīšanas (un dzesēšanas) laika skala \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) ir atkarīga no tās lieluma, saskaņā ar likumu \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), kur \ (L\ ) ir siltuma avota raksturīgais izmērs (lāzera stara diametrs mūsu pētījumā ir \(L\ aptuveni 100\) μm), \(D\) ir vides termiskā difūzija (vidējā mūsu korpuss, stikls un ūdens Difūzijas ātrums\(D\ apmēram 2\ reizes {10}^{-7}\) m2/s). var sagaidīt temperatūras izmaiņas, šī momentāna temperatūras paaugstināšanās ne tikai saīsina eksperimenta ilgumu, bet arī ļauj precīzi noteikt laiku \ (t = 0\) jebkuram temperatūras ietekmes dinamiskam pētījumam.
Mūsu piedāvātā metode ir piemērojama jebkuram gaismu absorbējošam substrātam (piemēram, komerciāliem paraugiem ar ITO pārklājumu). Tomēr zelta nanodaļiņas spēj nodrošināt augstu absorbciju infrasarkanajā starā un zemu absorbciju redzamajā diapazonā, kuras pēdējās īpašības ir interesantas efektīvai optiskai novērošanai redzamajā diapazonā, īpaši, ja tiek izmantota fluorescence. Turklāt zelts ir bioloģiski saderīgs, ķīmiski inerts, optisko blīvumu var regulēt no 530 nm līdz tuvajam infrasarkanajam staram, un parauga sagatavošana ir vienkārša un ekonomiska29.
Šķērsvirziena režģa viļņu frontes mikroskopija (CGM) ļauj ne tikai kartēt temperatūru mikromērogā, bet arī uzraudzīt biomasu, padarot to īpaši noderīgu (ja tas nav nepieciešams) kopā ar LA-HTM. Pēdējās desmitgades laikā ir izstrādātas citas temperatūras mikroskopijas metodes, īpaši bioattēlveidošanas jomā, un lielākajai daļai no tām ir jāizmanto temperatūras jutīgas fluorescējošas zondes54, 55. Tomēr šīs metodes ir kritizētas, un dažos ziņojumos ir mērītas nereālas temperatūras izmaiņas šūnās, iespējams, tādēļ, ka fluorescence ir atkarīga no daudziem citiem faktoriem, izņemot temperatūru. Turklāt lielākā daļa fluorescējošo zondu ir nestabilas augstā temperatūrā. Tāpēc QPM un jo īpaši CGM ir ideāla temperatūras mikroskopijas tehnika, lai pētītu dzīvi augstās temperatūrās, izmantojot optisko mikroskopiju.
Pētījumi ar S. shibatae, kas optimāli dzīvo 80°C temperatūrā, liecina, ka LA-HTM var izmantot ne tikai vienkāršu termofilu, bet arī hipertermofilu pētīšanai. Principā nav ierobežojumu temperatūras diapazonam, ko var sasniegt, izmantojot LA-HTM, un pat temperatūru virs 100°C var sasniegt atmosfēras spiedienā bez vārīšanās, kā to pierāda mūsu 38. grupa hidrotermālās ķīmijas lietojumos atmosfēras temperatūrā. spiediens A. Zelta nanodaļiņu 40 karsēšanai izmanto lāzeru tādā pašā veidā. Tādējādi LA-HTM var izmantot, lai novērotu nepieredzētus hipertermofīlus ar standarta augstas izšķirtspējas optisko mikroskopiju standarta apstākļos (ti, vides spriedzes apstākļos).
Visi eksperimenti tika veikti, izmantojot paštaisītu mikroskopu, ieskaitot Köhler apgaismojumu (ar LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), paraugu turētāju ar manuālu xy kustību, objektīvus (Olympus, 60x, 0,7 NA, gaisu, LUCPlanFLN60X vai 60x, NA, 1,25). , UPLFLN60XOI), CGM kamera (QLSI šķērsrežģis, 39 µm solis, 0,87 mm no Andor Zyla kameras sensora), lai nodrošinātu intensitātes un viļņu frontes attēlveidošanu, un sCMOS kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16 bitu režīms, no Hamamatsu), lai ierakstītu dati parādīti 5. attēlā (baktēriju peldēšana). Dihromiskais staru sadalītājs ir 749 nm BrightLine mala (Semrock, FF749-SDi01). Filtrs kameras priekšpusē ir 694 īstermiņa filtrs (FF02-694/SP-25, Semrock). Titāna safīra lāzers (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, sūknēts cunami lāzera dobums, Spectra-Physics 2-5. att., tālāk aizstāts ar Millenia lāzeru, Spectraphysics 10 W, sūknēts Mira lāzera dobums, Koherents, 2. att. -5). 6 un 7) ir iestatīti uz viļņa garumu \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, kas atbilst zelta nanodaļiņu plazmona rezonanses spektram. Telpiskie gaismas modulatori (1920 × 1152 pikseļi) tika iegādāti no Meadowlark Optics. Hologrammas tika aprēķinātas, izmantojot Gerchberg-Saxton algoritmu, kā aprakstīts 39.
Šķērsrežģa viļņu frontes mikroskopija (CGM) ir optiskās mikroskopijas metode, kuras pamatā ir divdimensiju difrakcijas režģa (pazīstama arī kā šķērsrežģa) apvienošana viena milimetra attālumā no parastā kameras sensora. Visizplatītākais CGM piemērs, ko esam izmantojuši šajā pētījumā, tiek saukts par četru viļņu garuma šķērseniskās nobīdes interferometru (QLSI), kur šķērsrežģis sastāv no intensitātes/fāzes šaha parauga, ko ieviesa un patentēja Primot et al. 2000. gadā34. Vertikālās un horizontālās režģa līnijas uz sensora rada režģim līdzīgas ēnas, kuru kropļojumus var skaitliski apstrādāt reāllaikā, lai iegūtu krītošās gaismas optisko viļņu frontes kropļojumu (vai līdzvērtīgu fāzes profilu). Lietojot mikroskopā, CGM kamera var parādīt attēlotā objekta optiskā ceļa atšķirību, kas pazīstama arī kā optiskais dziļums (OT), ar jutību nanometru kārtībā36. Jebkurā CGM mērījumā, lai novērstu jebkādus defektus optiskajos komponentos vai staros, ir jāuzņem primārais atsauces OT attēls un jāatņem no visiem turpmākajiem attēliem.
Temperatūras mikroskopija tika veikta, izmantojot CGM kameru, kā aprakstīts atsaucē. 32. Īsāk sakot, šķidruma karsēšana maina tā laušanas koeficientu, radot termiskās lēcas efektu, kas izkropļo krītošo staru kūli. Šo viļņu frontes kropļojumu mēra ar CGM un apstrādā, izmantojot dekonvolūcijas algoritmu, lai iegūtu trīsdimensiju temperatūras sadalījumu šķidrā vidē. Ja zelta nanodaļiņas ir vienmērīgi sadalītas visā paraugā, temperatūras kartēšanu var veikt vietās, kur nav baktēriju, lai iegūtu labākus attēlus, ko mēs dažreiz darām. Atsauces CGM attēls tika iegūts bez sildīšanas (ar izslēgtu lāzeru) un pēc tam tika uzņemts tajā pašā attēla vietā ar ieslēgtu lāzeru.
Sausās masas mērīšana tiek veikta, izmantojot to pašu CGM kameru, ko izmanto temperatūras attēlveidošanai. CGM atsauces attēli tika iegūti, ekspozīcijas laikā ātri pārvietojot paraugu x un y, lai noteiktu vidējo neviendabīgumu OT baktēriju klātbūtnes dēļ. No baktēriju OT attēliem to biomasa tika iegūta, izmantojot attēlu kopumu apgabalos, kas atlasīti, izmantojot Matlab paštaisītu segmentācijas algoritmu (skatīt apakšsadaļu “Ciparu kods”), ievērojot procedūru, kas aprakstīta atsaucē. 48. Īsāk sakot, mēs izmantojam relāciju \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), kur \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) ir optiskā dziļuma attēls, \(m\) ir sausais svars un \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) ir konstante. Mēs izvēlējāmies \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, kas ir tipiska dzīvu šūnu konstante.
Pārsegs 25 mm diametrā un 150 µm biezumā, kas pārklāts ar zelta nanodaļiņām, tika ievietots AttofluorTM kamerā (Thermofisher) ar zelta nanodaļiņām uz augšu. Pirms katras eksperimentu dienas Geobacillus stearothermophilus tika kultivēts pa nakti LB barotnē (200 apgr./min, 60 ° C). 5 µl pilienu G. stearothermophilus suspensijas ar optisko blīvumu (OD) no 0,3 līdz 0,5 uzlika uz pārklājuma ar zelta nanodaļiņām. Pēc tam uz piliena tika nolaista apaļa nosegplāksne 18 mm diametrā ar caurumu 5 mm diametrā centrā, un cauruma centrā atkārtoti tika uzklāts 5 μl baktēriju suspensijas ar tādu pašu optisko blīvumu. Akas uz segstikliņiem tika sagatavotas saskaņā ar procedūru, kas aprakstīta atsaucē. 45 (plašāku informāciju skatiet papildinformācijā). Pēc tam pārklājam uzklājiet 1 ml LB barotnes, lai novērstu šķidruma slāņa izžūšanu. Pēdējais pārklājošais stikls tiek novietots virs Attofluor™ kameras slēgtā vāka, lai inkubācijas laikā novērstu barotnes iztvaikošanu. Dīgšanas eksperimentiem mēs izmantojām sporas, kas pēc parastajiem eksperimentiem dažkārt nosedza augšējo pārklājumu. Līdzīga metode tika izmantota, lai iegūtu Sulfolobus shibatae. Trīs dienas (200 apgr./min., 75 °C) tika veikta Thiobacillus serrata iepriekšēja kultivēšana 182. barotnē (DSMZ).
Zelta nanodaļiņu paraugi tika sagatavoti ar micelāro bloku kopolimēra litogrāfiju. Šis process ir detalizēti aprakstīts sadaļā. 60. Īsumā, zelta jonus iekapsulējošās micellas tika sintezētas, sajaucot kopolimēru ar HAuCl4 toluolā. Pēc tam notīrītos pārklājumus iegremdēja šķīdumā un apstrādāja ar UV starojumu reducētāja klātbūtnē, lai iegūtu zelta sēklas. Visbeidzot, zelta sēklas tika audzētas, 16 minūtes kontaktējot pārklājuma stiklu ar KAuCl4 un etanolamīna ūdens šķīdumu, kā rezultātā tuvajā infrasarkanajā starā tika iegūts kvaziperiodisks un ļoti vienmērīgs nesfērisku zelta nanodaļiņu izvietojums.
Lai interferogrammas pārveidotu par OT attēliem, mēs izmantojām paštaisītu algoritmu, kā aprakstīts saitē. 33 un ir pieejama kā Matlab pakotne šādā publiskajā repozitorijā: https://github.com/baffou/CGMprocess. Pakete var aprēķināt intensitāti un OT attēlus, pamatojoties uz ierakstītajām interferogrammām (tostarp atsauces attēliem) un kameru masīvu attālumiem.
Lai aprēķinātu SLM piemēroto fāzes modeli, lai iegūtu noteiktu temperatūras profilu, mēs izmantojām iepriekš izstrādātu pašmāju algoritmu 39, 42, kas ir pieejams šajā publiskajā repozitorijā: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Ievade ir vēlamais temperatūras lauks, ko var iestatīt digitāli vai izmantojot vienkrāsainu bmp attēlu.
Lai segmentētu šūnas un izmērītu to sauso svaru, mēs izmantojām mūsu Matlab algoritmu, kas publicēts šādā publiskajā repozitorijā: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Katrā attēlā lietotājam jānoklikšķina uz interesējošās baktērijas vai mCFU, jāpielāgo zizļa jutība un jāapstiprina atlase.
Lai iegūtu papildinformāciju par studiju plānošanu, skatiet dabas pētījumu ziņojuma kopsavilkumu, kas ir saistīts ar šo rakstu.
Dati, kas apstiprina šī pētījuma rezultātus, pēc pamatota pieprasījuma ir pieejami no attiecīgajiem autoriem.
Šajā pētījumā izmantotais avota kods ir detalizēti aprakstīts sadaļā Metodes, un atkļūdošanas versijas var lejupielādēt no https://github.com/baffou/ šādās krātuvēs: SLM_temperatureShaping, CGMprocess un CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Ieskats termofilos un to plaša spektra pielietojumos. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Ieskats termofilos un to plaša spektra pielietojumos.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. un Sharma, AK Pārskats par termofiliem un to plašo pielietojumu. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. un Sharma AK Dziļa izpratne par termofiliem un plašu pielietojumu klāstu.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Izlikšanas laiks: 26. septembris 2022